特許ウォッチ

公開番号2025133705
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-09-11
出願番号2025026515
出願日2025-02-21
発明の名称核酸の正確な並列定量のための高感な方法
出願人ゲノミルヘルスオサケユイチア,Genomill Health Oy
代理人個人
主分類C12Q 1/6844 20180101AFI20250904BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】本開示は、例えば抽出されたDNA中の1つ以上の核酸標的を大容量及び/又は未精製試料材料中で正確かつ大規模な並列増幅及び定量のための方法に関する。
【解決手段】本発明は、遺伝子標的あたり2つの標的特異的核酸プローブ、ループオリゴ、及び架橋オリゴ又は架橋オリゴ複合体を含む。
【選択図】図2A

特許請求の範囲【請求項１】
複数の試料中の１つ以上の標的ヌクレオチド配列のハイスループット増幅及び任意選択のその後の検出のための方法であって、
前記方法は、
（ｉ）前記試料の各々における標的ヌクレオチド配列ごとに、
第１のプローブ、第２のプローブ、少なくとも１つのループオリゴ、及び架橋オリゴ又は前記ループオリゴにアニーリングして架橋オリゴ複合体を形成することができる複数の架橋オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、
前記第１のプローブが、前記第１のプローブの５’末端に第１の架橋オリゴ特異的配列、任意選択的に、第１の配列バーコード、及び前記第１のプローブの３’末端に第１の標的特異的部分を含み、
前記第２のプローブが、前記第２のプローブの５’末端に第２の標的特異的部分、任意選択的に、第２の配列バーコード、及び前記第２のプローブの３’末端に第２の架橋オリゴ特異的配列を含み、
前記ループオリゴが、分子の５’末端から出発して、第３の架橋オリゴ特異的配列、ループ配列、及び第４の架橋オリゴ特異的配列を含み、前記ループ配列が、任意選択的に、第３の配列バーコードを含み、前記ループ配列が、二本鎖部分が形成されるように互いにアニーリングすることができる２つの配列を含有し、前記二本鎖部分が、ニッキングエンドヌクレアーゼの認識部位を含み、
前記架橋オリゴ又は複数の架橋オリゴヌクレオチドが、それぞれ前記第１のプローブ及び前記第２のプローブ中の前記第１の架橋オリゴ特異的配列及び前記第２の架橋オリゴ特異的配列に相補的な配列、並びに前記ループオリゴ中の前記第３の架橋オリゴ特異的配列及び前記第４の架橋オリゴ特異的配列に相補的な配列を含有し、前記架橋オリゴ又は複数の架橋オリゴヌクレオチドが、任意選択的に、第４の配列バーコードを含み、
第１のシーケンスバーコード、第２のシーケンスバーコード、第３のシーケンスバーコード、又は第４のシーケンスバーコードのうちの少なくとも１つが存在する、工程と、
（ｉｉ）１つ以上の前記標的ヌクレオチド配列の各々について、前記第１のプローブ及び前記第２のプローブを、好ましくは別個のチューブ中の前記試料の各々について、前記架橋オリゴ又は複数の架橋オリゴヌクレオチド及び任意選択的に、前記ループオリゴと接触させ、プローブ複合体への自己アニーリングを可能にする工程であって、前記ループオリゴが付加された場合に、任意選択的に、前記ループオリゴと前記第１のプローブとの間及び／又は前記ループオリゴと前記第２のプローブとの間に存在する場合、一本鎖間隙を充填するために、前記架橋オリゴ又は前記複数の架橋オリゴヌクレオチドに相補的なさらなるオリゴヌクレオチドが含まれ、
（ｉｉａ）前記ループオリゴが工程（ｉｉ）で付加された場合、任意選択的に、存在する場合に、前記アニールされたプローブ複合体内の一本鎖間隙を充填するためにポリメラーゼ伸長を実行し、
（ｉｉｂ）前記ループオリゴが工程（ｉｉ）で付加された場合、任意選択的に、前記プローブ複合体の前記二本鎖部分をライゲートし、
ここで、工程（ｉｉｂ）が、工程（ｉｉａ）と同時に実行されてもよく、
（ｉｉｉ）前記ループオリゴが工程（ｉｉ）で付加されなかった場合、前記標的ヌクレオチド配列について試験される前記試料の各々に存在する核酸を前記プローブ複合体及び前記ループオリゴと接触させる工程と、
（ｉｖ）それぞれの前記第１のプローブ及び前記第２のプローブの前記第１の標的特異的部分及び前記第２の標的特異的部分を、前記標的配列上の本質的に隣接する部分にハイブリダイズさせ、前記ループオリゴが工程（ｉｉｉ）で付加された場合、前記ループオリゴを前記架橋オリゴ又は複数の架橋オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成させる工程と、
（ｖ）任意選択的に、前記複数の試料からの前記ハイブリダイゼーション複合体をプールする工程と、
（ｖｉ）前記ハイブリダイゼーション複合体中の前記プローブをライゲートして、ライゲートされたライゲーション複合体を提供する工程と、
（ｖｉｉ）鎖置換ポリメラーゼによるローリングサークル増幅を使用して１つ以上の前記ライゲートされたライゲーション複合体から核酸を増幅し、互いにアニーリングすることができる前記ループ配列中の２つの配列のアニーリングを可能にし、それにより、一本鎖部分及びニッキングエンドヌクレアーゼの前記認識部位を含む二本鎖部分を有するループ構造を含むコンカテマー分子を得る工程と、
（ｖｉｉｉ）前記認識部位に対する特異性を有するニッキングエンドヌクレアーゼで前記二本鎖部分をニッキングする工程と、
（ｉｘ）前記ニッキングされたコンカテマー分子が、相補的末端を有する別個のセグメントに崩壊するような変性工程を実行する工程と、
（ｘ）前記セグメントの前記相補的末端の分子内アニーリングを可能にし、前記別個のセグメントを分子内でライゲートし、それにより環状分子を得る工程と、を含み、
任意選択的に、以下の追加の工程を実行し、
（ｘｉ）工程（ｘ）で得られた前記環状分子をハイスループットシーケンシング技術に供して、前記バーコード配列を決定する工程、及び、
（ｘｉｉ）前記第１の標的特異的部分及び／もしくは前記第２の標的特異的部分の少なくとも一部、並びに／又は前記第１のバーコード及び／もしくは前記第２のバーコードの少なくとも一部、並びに／又は前記第３のバーコードの少なくとも一部及び／もしくは前記第４のバーコードの少なくとも一部の決定によって、前記複数の試料中の前記標的ヌクレオチド配列の存在及び／又は数を同定する工程、
工程（ｖ）及び（ｖｉ）が、任意の順序で実行されてもよい、
方法。
続きを表示（約 1,500 文字）【請求項２】
工程（ｘｉ）及び（ｘｉｉ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ループ配列内に含有される互いにアニーリングすることができる前記２つの配列が各々、少なくとも５塩基、例えば少なくとも６、７、８、９、又は少なくとも１０塩基の長さ、例えば１０～５０塩基、例えば１０～２５塩基、又は１０～１５塩基の長さを有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ニッキングエンドヌクレアーゼが、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ又はＮｂ．ＢｓｒＤＩである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記架橋オリゴ又は前記複数の架橋オリゴヌクレオチドの１つ以上のオリゴヌクレオチドが、前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、又は前記ループオリゴに相補的でない領域に、標的計数のための分子バーコードとしての使用に好適なランダム配列の組み込みを可能にする複数のユニバーサル塩基類似体を含み、
工程（ｖｉ）の一部として、そのようなランダム配列を生成するためにポリメラーゼ及びヌクレオチドを使用して間隙充填工程が実行される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記複数のユニバーサル塩基類似体が、複数の５－ニトロインドールである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｖ）の後且つ工程（ｖｉｉ）の前に、工程（ａ）及び工程（ｂ）が実行され、
ここで、工程（ａ）は、前記ライゲートされたライゲーション複合体を前記標的ヌクレオチド配列から解離させることを含み、工程（ｂ）は、前記標的ヌクレオチド配列に対応する配列を含む標的特異的プローブを付加することを含み、
ここで、前記標的特異的プローブが、前記ライゲートされたライゲーション複合体とアニーリングすることができ、前記標的特異的プローブを前記ライゲートされたライゲーション複合体とアニールし、それにより増幅鋳型を形成させ、
工程（ｖｉｉ）において、前記増幅鋳型が、鎖置換ポリメラーゼによるローリングサークル増幅によって増幅される、
請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、前記ループオリゴ、前記架橋オリゴ、又は前記複数の架橋オリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、第１の捕捉部分を含み、
工程（ｉｖ）と工程（ｖ）との間に、前記ハイブリダイゼーション複合体を第２の捕捉部分を含む固体支持体と接触させ、前記ハイブリダイゼーション複合体が、前記固体支持体に連結されるように前記第１の捕捉部分と前記第２の捕捉部分とを相互作用させ、前記固体支持体に連結されたハイブリダイゼーション複合体を前記固体支持体に連結されていない前記試料の成分から分離することを含む中間工程（ｉｖ）（ａ）が実行される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の試料が、血液試料、唾液試料、尿試料、又は糞便試料を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記架橋オリゴ又は前記複数の架橋オリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが、
（ｉ）１～５個の３’突出塩基、及び／又は
（ｉｉ）３’リン酸塩、及び／又は
（ｉｉｉ）３’末端から３位内の１つ以上のホスホロチオエート修飾、及び／又は
（ｉｖ）前記架橋をエキソヌクレアーゼ活性から保護し、かつ／もしくは３’末端からの増幅を防止する別の修飾、
を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本開示は、１つ以上の核酸標的の正確かつ大規模な並列増幅及び検出並びに定量のための改善された次世代ＤＮＡシーケンシング方法に関する。より詳細には、本開示は、主に遺伝子標的及び変異体の検出に使用される複雑なＤＮＡプール中の遺伝子標的を検出及び定量するためのプローブを使用する方法に関する。本発明は、遺伝子標的あたり１つ以上の標的特異的核酸プローブ、ループオリゴ、及び１つ以上の架橋オリゴを使用する。
続きを表示（約 2,800 文字）【背景技術】
【０００２】
遺伝的変異を研究する技術の進歩により、植物及び動物における遺伝的変異の検出は、面倒ではない。しかしながら、特に弱いシグナルを有する試料における突然変異などの遺伝的変異の検出及び正確な定量は、シーケンシングコストが低下しているにもかかわらず、現在のところ依然として面倒で、手間がかかり、高価である。コンセンサスバックグラウンドに対して遺伝的シグナルを検出するための特異性、弱い遺伝的シグナルを検出するための感度、検出されたシグナルを正確に定量するための精度、アッセイあたりの標的化遺伝子標的のスループット数、アッセイあたりのコスト、多数の試料を並行してアッセイするときのアッセイコストスケールを決定するためのスケーリング、及びサンプリングから結果までの時間がどれだけかを決定するためのターンオーバーなどの様々な問題をより正確に表現することができる。
【０００３】
現在、液体生検及び概念的に同様のアッセイ（抗生物質耐性遺伝子検出など）の典型的な定量方法には、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、アレイｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）、又は次世代ＤＮＡシーケンシングデータからの定量が含まれる。定量方法は、堅牢で確立された方法であるが、方法の各々は、以下でより詳細に考察する特定の問題に関連している：
【０００４】
定量ＰＣＲ：定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、ＰＣＲ中の、すなわちリアルタイムでの標的ＤＮＡ分子の増幅を含む技術である。リアルタイムＰＣＲは、定量的（定量的リアルタイムＰＣＲ）、及び半定量的、すなわち一定量のＤＮＡ分子より多い／少ない（半定量的リアルタイムＰＣＲ）、に使用され得る。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、遺伝子標的定量の絶対的な基準である。
現在、ｑＰＣＲ反応の実験室コストは約２ドルである。しかしながら、反応を準備するための相当な実践時間／ハンズオンタイム（労働コスト）、標準曲線の必要性、及び各定量化標的についての反復を考慮に入れると、事実、実際のコストははるかに高い。各遺伝子標的について別個の定量実験が必要とされるため、実践時間の総時間は試料数の増加に伴って急激に変化する。
【０００５】
アレイＰＣＲ：ＰＣＲアレイは、関連する経路又は疾患に焦点を当てた遺伝子のパネルの発現を分析するための最も信頼性の高いツールである。各９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、又は１００ウェルディスクＰＣＲアレイは、遺伝子の集中パネルの徹底的に研究されたパネルのためのＳＹＢＲＧｒｅｅｎ最適化プライマーアッセイを含む。ｑＰＣＲ技術のより新しい反復は、個々のｑＰＣＲ反応を小型化するアレイｑＰＣＲである。アレイＰＣＲは、個々のｑＰＣＲ反応のコストを下げ、多数の標的及び試料に対する方法のスケーラビリティを改善する。しかしながら、本方法は、現在、チップあたり数千ドルのコストに読み出しインフラストラクチャの大きな資本コストを加えて、１２個の試料から３８４個の標的（又は逆に３８４個の試料から１２個の標的）をプロファイリングすることに限定されている。したがって、前述の構成を使用して数千の試料をプロファイルすることは、法外に高価なままである。
【０００６】
デジタルＰＣＲ：デジタルポリメラーゼ連鎖反応（デジタルＰＣＲ、ＤｉｇｉｔａｌＰＣＲ、ｄＰＣＲ、又はｄｅＰＣＲ）は、液滴－マイクロ流体及び蛍光検出によって標的の絶対定量を提供する方法である。この方法論は、比較的費用対効果が高い（１試料あたり１つの標的のコストは、約３ドルである）が、各試料の標的ごとの個々の実験を準備、設定、及び稼働するためのハンズオン時間は、数千個の試料に拡大するには不十分である。
【０００７】
多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）は、個々の試料中の多数の遺伝子標的の検出を単純化するためのアプローチを提供する。しかしながら、ＭＬＰＡは、標的の相対的な定量しか提供せず、試料ごとに別個の検出実験を必要とする。さらに最近では、ＭＬＰＡの変異体は、ＤＮＡバーコード化から概念を導入している。この概念は、従来のＭＬＰＡワークフローよりも良好な定量的分解能及び試料多重化を可能にする。
【０００８】
次世代シーケンシングベースのアプローチ：配列ベースの遺伝子発現分析をアナログ技術の「デジタル」代替物にするハイスループットシーケンシングとしても知られる次世代シーケンシング（ＮＧＳ）。次世代ＤＮＡシーケンシングデータからの標的計数は、ＤＮＡシーケンシングのコストが減少し続けるにつれてますます魅力的になってきており、現在、例えば非侵襲的出生前検査で使用されている。しかしながら、現在のアプローチは、関連性のない遺伝子標的をシーケンシングするのに浪費される高いシーケンシングライブラリー調製コスト及びシーケンシング労力に悩まされている。
例えば、癌関連液体生検では、非標的化アプローチは、腫瘍学的に関連性のない遺伝子座に対するシーケンシング努力の無駄をもたらす。胎児診断において、遺伝子座の非標的化サンプリングは、データを解釈するための統計的選択肢をかなり制限する。ＧｕａｒｄａｎｔＨｅａｌｔｈＩｎｃは、ＲＮＡ捕捉プローブのアレイが次世代ＤＮＡシーケンシングの標的を濃縮する、より標的化されたシーケンシングアプローチを提供する。
【０００９】
Ａｋｈｒａｓら（２００７）ＰＬｏＳＯＮＥ２（２）：ｅ２２３は、バーコード化標的特異性プローブ、標的環状化及びシーケンシングを含む多重病原体検出アッセイを開示している。標的特異性プローブをライゲートするための架橋オリゴヌクレオチドの使用も開示される。
国際公開第２０１８／１０９２０６号は、パッドロックプローブとローリングサークル増幅を使用して試料中の分析物を検出する方法を示している。架橋オリゴの使用は記載されていない。
国際公開第２０１９／０３８３７２号は、目的の標的配列が、Ｔ７ポリメラーゼのためのプロモーターを含有するライゲーション複合体からのインビトロ転写によって選択的に増幅され、続いてｃＤＮＡ合成及びシーケンシングが行われる次世代シーケンシングアプローチを記載している。欧州特許出願公開第４０６００４９Ａ１号明細書に記載されている方法では、標的特異的ライゲーション複合体からのローリングサークル増幅が利用される。
【００１０】
これらの方法は、試料中の多くの標的配列の正確かつ並行した検出及び定量を可能にするが、より複雑で、大容量の、希釈された、かつ／又は不純な試料は困難なままである。
（【００１１】以降は省略されています）

関連特許