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公開番号2025131609
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-09-09
出願番号2025081746,2021532503
出願日2025-05-15,2019-08-16
発明の名称ドナー臓器における糖鎖抗原除去のための酵素組成物、それに関連する方法および使用
出願人ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア,ユニバーシティ・ヘルス・ネットワーク,UNIVERSITY HEALTH NETWORK
代理人個人,個人
主分類C12N 9/24 20060101AFI20250902BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】ドナー臓器からA抗原を酵素的に切断するための灌流流体、およびドナー臓器からex vivoでA抗原を酵素的に切断する方法を提供する。
【解決手段】灌流流体は、2つの酵素である、GalNAcデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼを含み、灌流流体は、さらに、緩衝細胞外溶液および/またはクラウディング剤を含んでもよい。さらに、本明細書に記載された組成物は、細胞生存性に適した温度およびpHレベルにおいて活性を有することが見出された。
【選択図】図2
特許請求の範囲【請求項１】
ドナー臓器からＡ抗原を酵素的に切断するための灌流流体であって、前記灌流流体は、
（ａ）精製ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質と、
（ｂ）精製ガラクトサミニダーゼタンパク質と、
を含む、灌流流体。
続きを表示（約 1,500 文字）【請求項２】
（ａ）ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼは、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、および配列番号３５のうちの１つ以上から選択される精製タンパク質であり、
（ｂ）ガラクトサミニダーゼは、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１９、配列番号２１、配列番号３６、および配列番号３７のうちの１つ以上から選択される精製タンパク質である、請求項１に記載の灌流流体。
【請求項３】
請求項１に記載の灌流流体であって、前記灌流流体は、配列番号２、４、５、１７、２３、２９、３１、および３２～３５のうちの１つの配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列から本質的になるＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ活性を有する精製酵素と、配列番号７、９、１０、１９、２１、３６および３７のうちの１つの配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列から本質的になるガラクトサミニダーゼ活性を有する精製酵素とを含む、灌流流体。
【請求項４】
請求項１または２に記載の灌流流体であって、前記灌流流体は、
（ａ）配列番号２、配列番号４および配列番号５の精製フラボニフラクター・プラウティＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質である、前記精製ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質と、
（ｂ）配列番号７、配列番号９および配列番号１０の精製フラボニフラクター・プラウティガラクトサミニダーゼタンパク質である、前記精製ガラクトサミニダーゼタンパク質と
の１つ以上から選択される酵素を含む、灌流流体。
【請求項５】
請求項１または２に記載の灌流流体であって、前記灌流流体は、
（ａ）配列番号１７または配列番号３２の精製クロストリジウム・テルチウムＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質である、前記精製ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質と、
（ｂ）配列番号１９または配列番号３６の精製クロストリジウム・テルチウムガラクトサミニダーゼタンパク質である、前記精製ガラクトサミニダーゼタンパク質と
の１つ以上から選択される、灌流流体。
【請求項６】
前記ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼが、１μｇ／ｍｌ以下でＡ抗原を切断することができる、請求項１～５のいずれか１つに記載の灌流流体。
【請求項７】
前記ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼが、約６．５と約７．５との間のｐＨでＡ抗原切断活性を有する、請求項１～６のいずれか１つに記載の灌流流体。
【請求項８】
前記ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼが、４°Ｃと３７°Ｃとの間の温度でＡ抗原切断活性を有する、請求項１～７のいずれか１つに記載の灌流流体。
【請求項９】
前記灌流流体が、緩衝細胞外溶液をさらに含む、請求項１～８のいずれか１つに記載の灌流流体。
【請求項１０】
前記緩衝細胞外溶液が、Ｓｔｅｅｎ（商標）、Ｐｅｒｆａｄｅｘ（商標）、ＰｅｒｆａｄｅｘＰｌｕｓ（商標）、ＥｕｒｏＣｏｌｌｉｎｓ溶液、ヒスチジン－トリプトファン－ケトグルタル酸（ＨＴＫ）溶液、ウィスコンシン大学溶液（ＵＷ）、Ｃｅｌｓｉｏｒ溶液、腎臓灌流溶液（ＫＰＳ－１）、京都大学溶液、ＩＧＬ－１溶液、およびクエン酸塩溶液から選択される、請求項９に記載の灌流流体。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１８年８月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／７１９，２７２号「糖鎖抗原切断のための酵素組成物、それに関連する方法、使用、装置およびシステム」の利益を主張する。
続きを表示（約 3,000 文字）【０００２】
本発明は、酵素組成物の分野に関する。特に、本発明は、ドナー臓器において抗原を切断するための酵素組成物、ならびに当該組成物を用いて抗原を切断するための方法および使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
血液型Ａの人の血漿がＢ抗原に対する抗体を含み、逆もまた同様であり、それによって不適合な輸血により補体の活性化と赤血球（ＲＢＣ）溶解を生じ得る（Ｄａｎｉｅｌｓ２０１０）ため、血液型の正確な適合は、輸血医学における中心的な要件である。これらの細胞表面抗原は、Ａ型血液およびＢ型血液それぞれに対して、α‐１，３‐結合‐Ｎ‐アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはガラクトース（Ｇａｌ）で終端する糖鎖構造である。一方、Ｏ型赤血球はこれらの末端糖を含まず、全般的に輸血され得る（Ｇａｒｒａｔｔｙ２００８）。したがって、患者の血液型が不明または不明確な場合である緊急時に備えて、Ｏ型赤血球を血液バンクに十分に供給する必要がある。しかし、供給は限られていることが多い。
【０００４】
ＡまたはＢＲＢＣをＯに変換する手段としてＡまたはＢＲＢＣからＧａｌＮＡｃまたはＧａｌ構造を酵素により除去する概念がＧｏｌｄｓｔｅｉｎ（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ１９８２；ＵＳ４６０９６２７およびＣＡ２２７２９２５）によって最初に提案され、実証された。グリーンコーヒー豆由来のα‐ガラクトシダーゼを用いて、Ｂ型ＲＢＣをＯ型に変換し、続いて輸血を行い、成功した（Ｋｒｕｓｋａｌｌ２０００）。しかしながら、必要とされた酵素量から、このアプローチは非実用的なものであった。Ａ型の変換はより困難であるが、これは主にＡ型の血液型は内部結合が異なる多くのサブタイプが存在するためである（Ｃｌａｕｓｅｎ１９８９）。同様に、α‐ガラクトシダーゼはＢ型抗原の除去に用いられている（例えば、ＥＰ２２４３７９３参照）。Ａ型の変換を含む実用的な変換への大きな進歩は、四糖類基質を用いて、ＡおよびＢ変換活性の両方に関する細菌のライブラリのスクリーニングによってなされた。中性ｐＨ値で高い抗原切断活性を示すグリコシダーゼの二つの新しいファミリーが発見された（ＣＡＺｙＧＨ１０９ α‐Ｎ‐アセチルガラクトサミニダーゼおよびＧＨ１１０ α‐ガラクトシダーゼ（Ｌｉｕ２００７））。両酵素はそれぞれの抗原を完全に除去して対応するＲＢＣを変換した。しかしながら、特にＡ型の変換には相当量の酵素が必要であり（６０ｍｇ酵素／血液単位）、さらなる発展を制限している。細胞から糖鎖抗原をより効率的に除去する酵素は有用であろう。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、部分的には、本明細書中に記載されるような、ガラクトサミニダーゼおよびＧａｌＮＡｃデアセチラーゼの組合せが、以前に同定されたＡ抗原切断酵素よりも桁違いに効率的であるという驚くべき発見に基づく。例えば、ある条件下では、いくつかのＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼ酵素は、１μ／ｍｌ以下でＡ抗原を切断でき得る。さらに、酵素の組み合わせによる切断効率は、赤血球の生存能力を維持するのに適したｐＨ（すなわち、約６．５と約７．５との間のｐＨ）において維持される。さらに、酵素は、４°Ｃと３７°Ｃとの間の温度で活性を有することが見出され、これはまた、血液の採取、洗浄および保存プロトコルに適している。さらに、酵素の効率は、クラウディング剤（例えばデキストラン）の添加によってさらに向上する。また、同じ２段階除去プロセスがドナー臓器に適用され得ることも理解されている。
【０００６】
しかしながら、ドナー臓器がより長く灌流される場合、より多くの酵素を使用してドナー臓器が灌流され得る時間を短縮することができ、またはより少ない酵素を使用することができることが、当業者によって理解されるであろう。
【０００７】
ある実施形態によれば、（ａ）精製ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質と、（ｂ）精製ガラクトサミニダーゼタンパク質と、を含む、ドナー臓器からＡ抗原を酵素的に切断するための灌流流体が提供される。
【０００８】
さらなる実施形態によれば、灌流流体が提供され、当該灌流流体は、（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、および配列番号３５のうちの１つ以上から選択される精製ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質と、（ｂ）配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１９、配列番号２１、配列番号３６および配列番号３７のうちの１つ以上から選択される精製ガラクトサミニダーゼタンパク質とを含む。
【０００９】
さらなる実施態様によれば、灌流流体が提供され、当該灌流流体は、配列番号２、４、５、１７、２３、２９、３１および３２～３５のうちの１つの配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列から本質的になるＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ活性を有する精製酵素と、配列番号７、９、１０、１９、２１、３６および３７のうちの１つの配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列から本質的になるガラクトサミニダーゼ活性を有する精製酵素とを含む。
【００１０】
酵素は、（ａ）配列番号２、配列番号４および配列番号５の精製フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉ）ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質である、精製ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質と、（ｂ）配列番号７、配列番号９および配列番号１０の精製フラボニフラクター・プラウティガラクトサミニダーゼタンパク質である、精製ガラクトサミニダーゼタンパク質との１つ以上から選択することができる。酵素は、（ａ）配列番号１７および配列番号３２の精製クロストリジウム・テルチウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｅｒｔｉｕｍ）ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質である精製ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質と、（ｂ）配列番号１９および配列番号３６の精製クロストリジウム・テルチウムガラクトサミニダーゼタンパク質である精製ガラクトサミニダーゼタンパク質との１つ以上から選択することができる。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、１μｇ／ｍｌ以下でＡ抗原を切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、約６．５と約７．５との間のｐＨでＡ抗原切断活性を有し得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、４°Ｃと３７°Ｃとの間の温度でＡ抗原切断活性を有し得る。灌流流体は、緩衝細胞外溶液をさらに含み得る。緩衝細胞外溶液は、Ｓｔｅｅｎ（商標）、Ｐｅｒｆａｄｅｘ（商標）、ＰｅｒｆａｄｅｘＰｌｕｓ（商標）、ＥｕｒｏＣｏｌｌｉｎｓ溶液、ヒスチジン－トリプトファン－ケトグルタル酸（ＨＴＫ）溶液、ウィスコンシン大学（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎ）溶液（ＵＷ）、Ｃｅｌｓｉｏｒ溶液、腎臓灌流溶液（ＫＰＳ－１）、京都大学（ＫｙｏｔｏＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）溶液、ＩＧＬ－１溶液、およびクエン酸塩溶液から選択することができる。
（【００１１】以降は省略されています）

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