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公開番号2025072512
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-05-09
出願番号2025017484,2022564304
出願日2025-02-05,2021-04-23
発明の名称スルフヒドリル化合物およびその誘導体を用いた酵素および経路調節
出願人エフ. ホフマン-ラロシュアーゲー,F. HOFFMANN-LA ROCHE AKTIENGESELLSCHAFT
代理人弁理士法人津国
主分類C07K 16/18 20060101AFI20250430BHJP(有機化学)
要約【課題】B細胞に関連するがん、またはパーキンソン病の治療等に有用な抗体を提供する。
【解決手段】本発明は、モノガラクトシル化(G1)グリカンおよびジガラクトシル化(G2)グリカンを有するタンパク質、特に抗CD20/抗CD3二重特異性抗体および抗α-シヌクレイン抗体等の抗体に関する。より詳細には、本発明は、力価が増加したタンパク質を含む、改善された治療特性を有するタンパク質を生成するためのガラクトシル化操作に関する。さらに、本発明は、細胞培養培地および哺乳動物細胞、ならびに前記タンパク質を産生するために前記細胞培養培地および前記哺乳動物細胞を使用する方法に関する。さらに、本発明は、がん、特にB細胞に関連するがん、またはパーキンソン病の処置等のための医薬としての前記抗体の使用に関する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
モノガラクトシル化（Ｇ１）グリカンおよびジガラクトシル化（Ｇ２）グリカンを有する抗α－シヌクレイン抗体であって、
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および
（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；ならびに
（ｄ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
（ｅ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｆ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、
前記抗α－シヌクレイン抗体が、総グリカンあたり１７．２～４８．０％（ｗ／ｗ）のＧ１および３．１～１５．０％（ｗ／ｗ）のＧ２；好ましくは、総グリカンあたり２５．４～４８．０％（ｗ／ｗ）のＧ１および３．５～１５．０％（ｗ／ｗ）のＧ２；好ましくは、総グリカンあたり２７．２～４７．０％のＧ１および４．４～１５．０％のＧ２；好ましくは、総グリカンあたり４０．０～４６．０％（ｗ／ｗ）のＧ１および８．４～１５．０％（ｗ／ｗ）のＧ２；より好ましくは、総グリカンあたり４１．０～４５．０％（ｗ／ｗ）のＧ１および９．５～１４．０％（ｗ／ｗ）のＧ２、最も好ましくは総グリカンあたり４２．１～４３．９％（ｗ／ｗ）のＧ１および１０．６～１３．３％（ｗ／ｗ）のＧ２を有する、抗α－シヌクレイン抗体。
続きを表示（約 2,400 文字）【請求項２】
（ａ）配列番号１６のＶＨ配列、
（ｂ）配列番号１７のＶＬ配列、または
（ｃ）（ａ）に記載のＶＨ配列および（ｂ）に記載のＶＬ配列
を含む、請求項１に記載の抗α－シヌクレイン抗体。
【請求項３】
配列番号２０の重鎖と配列番号２１の軽鎖とを含む、請求項１または２に記載の抗α－シヌクレイン抗体。
【請求項４】
モノガラクトシル化（Ｇ１）グリカンおよびジガラクトシル化（Ｇ２）グリカンを有する抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体であって、第１の抗原結合ドメイン、および第２の抗原結合ドメインを含み、前記第１の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
（ｂ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および
（ｃ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；ならびに
（ｄ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
（ｅ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｆ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、
前記第２の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
（ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および
（ｃ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；ならびに
（ｄ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
（ｅ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および
（ｆ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、
前記抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、総グリカンあたり、１９．０～２９．０％（ｗ／ｗ）のＧ１および１．３～２．８％（ｗ／ｗ）のＧ２、好ましくは、総グリカンあたり２０．０～２８．０％（ｗ／ｗ）のＧ１および１．４～２．７％（ｗ／ｗ）のＧ２、より好ましくは、総グリカンあたり２１．０～２８．０％（ｗ／ｗ）のＧ１および１．５～２．７％（ｗ／ｗ）のＧ２、最も好ましくは総グリカンあたり２１．０～２７．４％（ｗ／ｗ）のＧ１および１．５～２．６％（ｗ／ｗ）のＧ２を有する、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項５】
（ａ）前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号２８のＶＨ配列および配列番号２９のＶＬ配列を含み、
（ｂ）前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号４０のＶＨ配列および配列番号４１のＶＬ配列を含み、
（ｃ）前記第１の抗原結合ドメインおよび前記第２の抗原結合ドメインが、（ａ）に記載のＶＨ配列および（ｂ）に記載のＶＬ配列を含む、
請求項４に記載の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項６】
（ａ）配列番号４６の第１の重鎖および配列番号４５の第２の重鎖、
（ｂ）配列番号３３の第１の軽鎖および配列番号４４の第２の軽鎖、または
（ｃ）（ａ）に記載の第１の重鎖および第２の重鎖ならびに（ｂ）に記載の第１の軽鎖および第２の軽鎖
を含む、請求項４または５に記載の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項７】
（ａ）配列番号４７の第１の重鎖および配列番号４５の第２の重鎖
（ｂ）配列番号３３の第１の軽鎖、配列番号４４の第２の軽鎖および第３の軽鎖；または
（ｃ）（ａ）に記載の第１の重鎖および第２の重鎖ならびに（ｂ）に記載の第１の軽鎖、第２の軽鎖および第３の軽鎖
を含む、請求項４～６のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項８】
請求項１～３のいずれか一項に記載のモノガラクトシル化（Ｇ１）グリカンおよびジガラクトシル化（Ｇ２）グリカンを有するα－シヌクレイン抗体を産生する方法であって、
（ａ）細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養することであって、前記細胞培養培地中の少なくとも４．０ｍＭ超および１０．０ｍＭ未満の、１つ以上のスルフヒドリル化合物由来のスルフヒドリル基および少なくとも３．０ｇ／Ｌ超のグルコースの濃度が、少なくとも３日間、より好ましくは少なくとも４日間、さらにより好ましくは少なくとも５日間維持される、細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養することと、
（ｂ）前記抗体を単離することと
を含む、方法。
【請求項９】
請求項４～７のいずれか一項に記載のモノガラクトシル化（Ｇ１）グリカンおよびジガラクトシル化（Ｇ２）グリカンを有する抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体を産生する方法であって、
（ａ）細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養することであって、前記細胞培養培地中の少なくとも４．０ｍＭ超および１０．０ｍＭ未満の、１つ以上のスルフヒドリル化合物由来のスルフヒドリル基および少なくとも３．０ｇ／Ｌ超のグルコースの濃度が、少なくとも３日間、より好ましくは少なくとも４日間、さらにより好ましくは少なくとも５日間維持される、細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養することと、
（ｂ）前記抗体を単離することと
を含む、方法。
【請求項１０】
前記濃度が、少なくとも５日間、好ましくは少なくとも７日間、より好ましくは少なくとも１０日間、さらにより好ましくは少なくとも１２日間、最も好ましくは少なくとも１４日間維持される、請求項８または９に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、モノガラクトシル化（Ｇ１）グリカンおよびジガラクトシル化（Ｇ２）グリカンを有するタンパク質、特に抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体および抗α－シヌクレイン抗体等の抗体に関する。より詳細には、本発明は、力価が増加したタンパク質を含む、改善された治療特性を有するタンパク質を生成するためのガラクトシル化操作に関する。さらに、本発明は、細胞培養培地および哺乳動物細胞、ならびに前記タンパク質を産生するために前記細胞培養培地および前記哺乳動物細胞を使用する方法に関する。さらに、本発明は、がん、特にＢ細胞に関連するがん、またはパーキンソン病の治療等のための医薬としての前記抗体の使用に関する。
続きを表示（約 3,800 文字）【背景技術】
【０００２】
背景
多くの糖タンパク質は、バイオテクノロジー産業の主要な製品であり、特に治療目的で利用されてきた。例としては、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、治療用モノクローナル抗体（治療用ｍＡｂ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、インターフェロン－α、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）（Ｃｕｍｍｉｎｇｅｔａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１：１１５－１３０（１９９１））が挙げられる。それにより、糖タンパク質のオリゴ糖構成要素は、それに限定されないが、物理的安定性、プロテアーゼ攻撃に対する耐性、免疫系との相互作用、薬物動態および比生物学的活性を含む、治療用糖タンパク質の有効性に関連するそれらの特性に影響を及ぼし得る。このような特性は、オリゴ糖の有無だけでなく、具体的な構造にも依存し得る。
【０００３】
一般的に、ネイティブな形態の免疫グロブリンまたは抗体は、通常、２つの軽鎖および２つの重鎖で構成される四量体糖タンパク質である。このような免疫グロブリンは、一般的に、重鎖定常領域の保存された位置にオリゴ糖を含有し、これは、タンパク質の集合、分泌または機能的活性に様々に影響を及ぼし得る（Ｂｏｙｄら、（１９９５）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１３１１－１３１８；ＷｉｔｔｗｅｒＡ．，ａｎｄＨｏｗａｒｄ，Ｓ．Ｃ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：４１７５－４１８０；Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．，ａｎｄＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈ．１５：２６－３２（１９９７）。
【０００４】
例えば、抗体のガラクトシル化の増加は、例えば、マウスにおいてＩｇＧ免疫複合体の高いガラクトシル化がＦｃγＲＩＩＢとデクチン－１との会合を促進し、Ｃ５ａＲおよびＣＸＣＲ２２６の炎症促進性エフェクター機能を遮断することを示すＫａｒｓｔｅｎら（ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ１８．９（２０１２）１４０１－１４０６）の報告によって記載されているように、機能的により抗炎症性であり得る。ＩｇＧ分子に対するガラクトシル化の他の報告された効果には、立体配座および表面接近性（Ｋｒａｐｐら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２５（２００３）９７９－８９；Ｍｉｍｕｒａら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７（２０００）６９７－７０６）等の物理化学的特性の改変が含まれる。ＦｏｒｔｕｎａｔｏおよびＣｏｌｉｎａ（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１１８（２０１４）９８４４－９８５１）は、明示的な水原子分子動力学シミュレーションを使用して、免疫グロブリンＧ１のＦｃドメインにおけるガラクトシル化の効果を研究した。彼らは、グリコシル化が、治療的処置のためのモノクローナル抗体の凝集耐性を改善するための経路として使用され得ることを示唆した。
【０００５】
様々な糖タンパク質のグリコシル化のレベルおよび／またはグリコシル化パターンがそれらの特性、特に治療有効性に関連する特性に及ぼす影響を考慮して、特に臨床使用のために生産される糖タンパク質のグリコシル化パターンが均一であり、したがって抗体の好ましい特性が少なくとも保持されることを確実にすることが重要である。
【０００６】
しかしながら、典型的には、宿主細胞における組換え糖タンパク質の発現は、産生された糖タンパク質が複数のグリコフォームとして存在するように、特定のグリコシル化部位に結合したオリゴ糖構造の変化をもたらす。したがって、これまで、所与の治療用タンパク質産生プロセスにおいて、インビボで産生細胞内のグリコシル化レベルおよび／またはグリコシル化パターンを正確に調節および制御することは技術的に非常に困難であった。
【０００７】
過去数十年の間に、様々な方法が提案されており、オリゴ糖産生に関与する特定の酵素の宿主細胞への導入または過剰発現（米国特許第５．０４７，３５５号、米国特許第５，５１０，２６１号）、酸素化レベル、ｐＨ、精製スキームなどの変化（Ｗｅｒｎｅｒ，Ｒ．およびＮｏｅ，Ｗ．（１９９３）、ＤｒｕｇＲｅｓ．４３：１１３４－１１３９；Ｗｅｒｎｅｒ，Ｒ．およびＮｏｅ，Ｗ．（１９９３）、ＤｒｕｇＲｅｓ．４３：１２４２－１２４９；Ｈａｙｔｅｒら、（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈ、およびＢｉｏｅｎｇ．３９：３２７～３３５；Ｂｏｒｙｓら（１９９４）、ＢｉｏｔｅｃｈおよびＢｉｏｅｎｇ．４３：５０５－５１４；Ｂｏｒｙｓら、（１９９３）、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：７２０～７２４；Ｈｅａｒｉｎｇら、（１９８９）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１０８：３３９－３５３；Ｇｏｏｃｈｅｅｅｔａｌ．，ｉｎＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇＩＩ，Ｔｏｄｄｅｔａｌ．，ｅｄｓ（１９９２）ＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙｐｐ．１９９－２４０；米国特許第５，０９６，８１６号明細書；Ｃｈｏｔｉｇｅａｔ，Ｗ，（１９９４）、Ｃｙｔｏｔｅｃｈ．１５：２１７－２２１）を含む、宿主細胞における糖タンパク質のグリコシル化パターンを変化させ得るいくつかのプロセスパラメータが研究されている。
【０００８】
上に概説したように、望ましいグリコシル化レベルおよび／またはグリコシル化パターンを有する糖タンパク質の産生は、前記抗体の好ましい特性、特にその治療有効性に関連する特性を少なくとも保持し、任意に最適化するために重要である。
【０００９】
技術的課題は、以下に提供され、添付の特許請求の範囲において特徴付けられる実施形態を提供することによって解決される。
【発明の概要】
【００１０】
発明の概要
過去数年の間に、ＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞におけるタンパク質ガラクトシル化プロセスを根本的に理解し、技術的に制御するための多くの努力がなされてきた。これまでに、タンパク質グリコシル化の程度に影響を及ぼすために使用することができるいくつかの一般的な戦略があり、その効果：１）グリコシルトランスフェラーゼの活性の改善、２）ヌクレオチド糖転移のためのヌクレオチド糖トランスポーターの利用可能性および活性の改善、３）ヌクレオチド糖基質の利用可能性の増加および４）細胞外グリカン分解に対するグリコシダーゼの低減は多くの場合、細胞型および産物特異的である（Ｈｏｓｓｌｅｒら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１９（９）（２００９）９３６－９４９；Ｈｏｓｓｌｅｒ，ＧｅｎｏｍｉｃｓａｎｄＳｙｓｔｅｍｓＢｉｏｌｏｇｙｏｆＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ１２７（２０１２）１８７－２１９）。Ｃｒｏｗｅｌｌら（ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ９６（３）（２００７）５３８－５４９）は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ複合体およびβ１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼの両方の好ましい補因子であるマンガンのＣＨＯ細胞培養物への補充により、後期培養におけるｒｈＥＰＯＮ－グリカンの部位占有率およびβ１，４－ガラクトシル化が増加することを示した。Ｇｒａｍｅｒら（ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ．１０８（７）（２０１１）１５９１－６０２））は、ウリジン、ＭｎＣｌ
２
、およびガラクトースの相乗的組合せが、供給される総ＵＭＧ濃度に対してｍＡｂガラクトシル化を定量的に有意に増加させることを報告した。グリコシルトランスフェラーゼおよびヌクレオチド糖トランスポーター（Ｊｅｏｎｇら、ＪＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１８（１２）（２００８）１９４５－１９５２；Ｗｅｉｋｅｒｔら、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１７（１１）（１９９９）１１１６－１１２１）の過剰発現および／またはノックダウンを使用するいくつかのアプローチも報告されている。ヌクレオチド糖前駆体の供給は、組換えタンパク質のグリコシル化を制御するための可能な戦略として報告されている（Ｗｏｎｇら、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ１０７．２（２０１０）３２１－３３６）。具体的には、細胞培養培地へのガラクトース、グルコサミンおよびＮ－アセチルマンノサミンの添加は、細胞内ヌクレオチド糖レベルを上昇させることが証明されている。しかしながら、グリコシル化遺伝子発現に対する細胞内ヌクレオチド糖レベルの上昇の影響は、十分に特徴付けられていない。さらに、細胞内ヌクレオチド糖レベルの上昇は、必ずしも組換えタンパク質のグリコシル化の改善をもたらさなかった。いくつかの研究は、タンパク質グリコシル化を改善する目的で、細胞グリコシダーゼをノックダウンする戦略を採用した（Ｎｇａｎｔｕｎｇら、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ．９５（１）（２００６）１０６－１９）。しかしながら、この手法は、機能する場合としない場合があった。要約すると、種々の外部因子が細胞内ガラクトシル化プロセスにどのように影響するかを調査するための基礎研究が依然として必要とされている。
（【００１１】以降は省略されています）

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