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公開番号2025066749
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-04-23
出願番号2025004021,2022523878
出願日2025-01-10,2020-06-01
発明の名称多特異性結合タンパク質において鎖誤対合を分析する方法
出願人サノフイ,SANOFI
代理人個人,個人
主分類C07K 16/18 20060101AFI20250416BHJP(有機化学)
要約【課題】細胞株による多特異性結合タンパク質および1つまたはそれ以上の誤対合種の産生をモニタリングする方法、ならびにそれに関連する産生およびスクリーニングの方法を提供する。
【解決手段】一部の実施形態では、方法は、サイズ排除超高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析(SE-UPLC-MS)によって、細胞培養培地中の多特異性結合タンパク質および1つまたはそれ以上の誤対合種の量(例えば、相対量)を検出することを含む。一部の実施形態では、多特異性結合タンパク質は、多特異性抗体、抗体断片またはFc融合タンパク質である。
【選択図】図1B
特許請求の範囲【請求項１】
多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の産生をモニタリングする方法であって、
サイズ排除超高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析（ＳＥ－ＵＰＬＣ－ＭＳ）によって、多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種を含む細胞培養培地中の多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の量を検出し、それにより多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の産生をモニタリングすること
を含み、
多特異性結合タンパク質は、少なくとも第１のポリペプチド鎖および第１のポリペプチド鎖と異なる第２のポリペプチド鎖を含む２本以上のポリペプチド鎖の会合を含み；
１つまたはそれ以上の誤対合種は、第１のおよび第２のポリペプチド鎖の少なくとも１本を多特異性結合タンパク質のもの以外の会合で含む２本以上のポリペプチド鎖を含む、前記方法。
続きを表示（約 1,800 文字）【請求項２】
多特異性結合タンパク質は、第１の抗体重鎖、第１の抗体軽鎖、第１の抗体重鎖と異なる第２の抗体重鎖および第１の抗体軽鎖と異なる第２の抗体軽鎖を含む多特異性抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１つまたはそれ以上の誤対合種は：
（ｉ）２本の第１の抗体重鎖を含む多特異性抗体の４本のポリペプチド鎖の会合；
（ｉｉ）２本の第２の抗体重鎖を含む多特異性抗体の４本のポリペプチド鎖の会合；
（ｉｉｉ）２本の第１の抗体軽鎖を含む多特異性抗体の４本のポリペプチド鎖の会合；および
（ｉｖ）２本の第２の抗体軽鎖を含む多特異性抗体の４本ポリペプチド鎖の会合
の１つまたはそれ以上を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
多特異性結合タンパク質は、３個の抗原結合部位を形成する４本のポリペプチド鎖を含み、
結合タンパク質の第１のポリペプチド鎖は、式：
Ｖ
Ｌ２
－Ｌ
１
－Ｖ
Ｌ１
－Ｌ
２
－Ｃ
Ｌ
［Ｉ］
によって表される構造を含み、
結合タンパク質の第２のポリペプチド鎖は、式：
Ｖ
Ｈ１
－Ｌ
３
－Ｖ
Ｈ２
－Ｌ
４
－Ｃ
Ｈ１
－ヒンジ－Ｃ
Ｈ２
－Ｃ
Ｈ３
［ＩＩ］
によって表される構造を含み、
結合タンパク質の第３のポリペプチド鎖は、式：
Ｖ
Ｈ３
－Ｃ
Ｈ１
－ヒンジ－Ｃ
Ｈ２
－Ｃ
Ｈ３
［ＩＩＩ］
によって表される構造を含み、
結合タンパク質の第４のポリペプチド鎖は、式：
Ｖ
Ｌ３
－Ｃ
Ｌ
［ＩＶ］
によって表される構造を含み、
式中：
Ｖ
Ｌ１
は第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
Ｖ
Ｌ２
は第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
Ｖ
Ｌ３
は第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
Ｖ
Ｈ１
は第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
Ｖ
Ｈ２
は第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
Ｖ
Ｈ３
は第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
Ｃ
Ｌ
は免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
Ｃ
Ｈ１
は免疫グロブリンＣ
Ｈ１
重鎖定常ドメインであり；
Ｃ
Ｈ２
【請求項５】
１つまたはそれ以上の誤対合種は：
（ｉ）式Ｉによる２本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質の４本のポリペプチド鎖の会合；
（ｉｉ）式ＩＩによる２本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質の４本のポリペプチド鎖の会合；
（ｉｉｉ）式ＩＩＩによる２本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質の４本のポリペプチド鎖の会合；および
（ｉｖ）式ＩＶによる２本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質の４本のポリペプチド鎖の会合
の１つまたはそれ以上を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の量を検出することは、ＭＳによって得られた１つまたはそれ以上のＭＳスペクトルをデコンボリュートすることを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
１つまたはそれ以上の誤対合種と比較した多特異性結合タンパク質の相対量が検出される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
１つまたはそれ以上の個々の誤対合種の量と比較した多特異性結合タンパク質の相対量が検出される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
誤対合種の全体量と比較した多特異性結合タンパク質の相対量が検出される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
細胞培養培地は細胞培養採取物である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６２／９２６，３１３号、２０１９年１０月２５日出願およびＥＰ出願第ＥＰ２０３１５２７１．５号、２０２０年５月２８日出願に優先権を主張し、それぞれの開示はその全体を参照により本明細書に組み入れる。
続きを表示（約 2,600 文字）【０００２】
ＡＳＣＩＩＴＥＸＴＦＩＬＥでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩｔｅｘｔｆｉｌｅでの以下の提出物の内容は、その全体を参照により本明細書に組み入れる：配列表のコンピューター可読形態（ＣＲＦ）（ファイル名：１８３９５２０３２８４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、データ記録：２０２０年５月２９日、サイズ：２ＫＢ）。
【０００３】
分野
本開示は、宿主細胞による多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種（ｍｉｓｐａｉｒｅｄｓｐｅｃｉｅｓ）の産生をモニタリングする方法、ならびにそれに関連する産生およびスクリーニングの方法に関する。本開示は、宿主細胞による抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種（ｗｅｉｇｈｔｖａｒｉａｎｔｓｐｅｃｉｅｓ）の産生をモニタリングする方法、ならびにそれに関連する産生およびスクリーニングの方法にさらに関する。
【背景技術】
【０００４】
同じまたは異なる抗原上の２つ以上の異なるエピトープに結合する多特異性抗体は、近年、がん免疫学（ｉｍｍｕｎｅ－ｏｎｃｏｌｏｇｙ）における魅力的な治療選択肢になった（非特許文献１）。マルチターゲットは、薬物特異性の増強を達成すること、またはシグナル伝達経路において天然リガンドを模倣すること、例えば、同じ細胞表面上の受容体対への同時結合を通じた血友病処置において（非特許文献２）などのさまざまな目的のために使用されている。有名な適用は、分子の一方のアームがＣＤ３／ＣＤ２８受容体結合を介してＴ細胞を活性化し、他方のアームが腫瘍死滅のための腫瘍抗原を標的化するＴ細胞エンゲージャー（ＴＣＥ）コンセプトである（非特許文献３；非特許文献４）。
【０００５】
ＩｇＧ様三重特異性抗体（ｔｓＡｂ）は、２本の異なる重鎖および２本の異なる軽鎖を含み、一般に単一の宿主細胞において発現され、細胞内鎖アセンブリが続く。この産生方法は、２つの別々の細胞株および精製工程を用いる必要性を省く一方で、望ましいｔｓＡｂに加えて望ましくない誤対合種を生成する可能性がある。合理的な設計の欠如およびサブユニットの無作為な会合で、正しく対合した種の理論的収率は、１２．５％しかない（図１Ｂ）。重鎖の強制的ヘテロ二量体化は、ノブと穴（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）設計（非特許文献５）などのタンパク質工学アプローチを通じて良好に達成された。しかし、軽鎖の正しい重鎖への同族対合は、ｔｓＡｂ産生における重要な課題のままである。
【０００６】
そのため、多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の産生をモニタリングするまたは分析する方法の必要性が残っている。加えて、さまざまな分子量の複数の種（例えば、化学修飾されたシステインもしくは他の残基などのさまざまな化学修飾を有する、またはさまざまなグリコフォームを有する）を含む抗体または抗体派生体の産生をモニタリングするまたは分析する方法の必要性が残っている。
【０００７】
特許出願、特許公開およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号を含む
本明細書に引用されるすべての参考文献は、個々の参考文献を参照により組み入れると具体的かつ個別に示されたのと同様に、その全体を参照により組み入れる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐ．Ａ．＆Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ，Ｃ．、「ＣａｎｃｅｒＲｅｓ２００９，６９（１２）」、４９４１～４頁
Ｋｉｔａｚａｗａ，Ｔ．ら、「ＮａｔＭｅｄ２０１２，１８（１０）」、１５７０～４頁
Ｋｒａｈ，Ｓ．ら、「ＮＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２０１７，３９（ＰｔＢ）」、１６７～１７３頁
Ｃｏｒｒｅｎｔｉ，Ｃ．Ｅ．ら、「Ｌｅｕｋｅｍｉａ２０１８，３２（５）」、１２３９～１２４３頁
Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．ら、「ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ１９９６，９（７）」、６１７～２１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これらおよび他の必要に応えるために、多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の（例えば、細胞株による）産生をモニタリングする方法が本明細書で提供される。これらの方法は、鎖誤対合および他のＩｇＧ関連種の同定および相対的定量のための変性ＳＥＣ－ＬＣ－インタクトＭＳに基づくハイスループット分析プラットホームをとりわけ提供する。有利にはこれらの方法は、時間がかかり、費用がかかる精製（例えば、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー）および緩衝液交換ステップを迂回して、清澄化された細胞採取物から直接ｍＡｂ関連種（例えば、多特異性結合タンパク質、抗体、Ｆｃ融合タンパク質、抗体断片など）のインタクトＭＳ分析を可能にする。そこでこれらの方法は、潜在的な産生細胞株について多数のクローンを迅速にスクリーニングするために使用できる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一部の実施形態では、多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の産生をモニタリングする方法であって、サイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ－ｅｘｃｌｕｓｉｏｎｕｌｔｒａ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）および質量分析（ＳＥ－ＵＰＬＣ－ＭＳ）によって、多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種を含む細胞培養培地中の多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の量を検出することを含む方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、多特異性結合タンパク質は、少なくとも第１のポリペプチド鎖および第１のポリペプチド鎖と異なる第２のポリペプチド鎖を含む２本以上のポリペプチド鎖の会合を含み、１つまたはそれ以上の誤対合種は、第１のおよび第２のポリペプチド鎖の少なくとも１本を多特異性結合タンパク質のもの以外の会合で含む２本以上のポリペプチド鎖を含む。
（【００１１】以降は省略されています）

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