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公開番号2025061666
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-04-11
出願番号2024224838,2021564783
出願日2024-12-20,2020-03-03
発明の名称RNAアプタマー及びその使用
出願人ユニバーシティオブマイアミ
代理人個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/115 20100101AFI20250403BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】腫瘍浸潤性骨髄細胞に特異的に結合するRNAアプタマーの提供。
【解決手段】腫瘍浸潤性骨髄細胞に特異的に結合するRNAアプタマー及びその使用が本明細書に記載される。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
治療剤にコンジュゲートしたＲＮＡアプタマーであって、前記アプタマーが、腫瘍浸潤性骨髄細胞上に発現された標的に特異的に結合する、アプタマー。
続きを表示（約 620 文字）【請求項２】
前記治療剤が核酸分子である、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項３】
前記核酸分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項４】
前記治療剤が化学療法剤である、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項５】
前記化学療法剤がドキソルビシンである、請求項４に記載のアプタマー。
【請求項６】
腫瘍浸潤性骨髄細胞上に発現される前記標的がアネキシン又はビメンチンである、請求項１～５のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項７】
治療剤を腫瘍浸潤性骨髄細胞に送達する方法であって、前記細胞を請求項１～６のいずれか１項に記載のアプタマーと接触させることを含む、方法。
【請求項８】
生体試料中の腫瘍浸潤性骨髄細胞の存在を検出する方法であって、検出可能な標識にコンジュゲートした請求項１～６のいずれか１項に記載のアプタマーと前記試料を接触させることを含む、方法。
【請求項９】
がんの治療を必要とする対象においてがんを治療する方法であって、請求項４～６のいずれか１項に記載のアプタマーを前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１０】
前記対象が、乳がん、結腸がん、腎臓がん、頭頸部がん又は黒色腫を患っている、請求項１０に記載の方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年３月７日に出願された米国仮出願第６２／８１５，１４２号の優先権の利益を主張し、該仮出願の開示は参照により全体が本明細書に援用される。
続きを表示（約 8,700 文字）【０００２】
米国政府の利益に関する声明
本発明は、米国国防総省により授与されたＢＣ０８４３３７の下での政府の支援と共に為された。政府は本発明においてある特定の権利を有する。
【０００３】
電子的に提出された資料の参照による援用
本出願は、本開示の別々の部分として、コンピュータ読み取り可能な形態の配列表（ファイル名：５３９５２Ａ＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；サイズ：１３，２４１バイト；作成：２０２０年３月２日）を含有し、これは参照により全体が援用される。
【背景技術】
【０００４】
異なる細胞毒性剤を使用する化学療法は、ほとんどのヒト悪性腫瘍に対する標準治療である。しかしながら、これらの治療は、がんを有する患者の全体的な生活の質を減少させる中等度～深刻な毒性と関連付けられ、多くの場合に用量制限的であり、したがって控えめな治療有効性の原因となる（１、２）。腫瘍部位において化学療法剤を濃縮することを目的とした薬物送達ナノプラットフォームは、全身毒性を減少させかつ有効性を増加させるためのモダリティーとして関心を集めている（２～４）。しかしながら、ほとんどのナノプラットフォームは、腫瘍血管系の物理的特性、例えば増強された透過性及び保持（ＥＰＲ）効果（５）、又は新生物性細胞を特徴付けるマーカーの存在のいずれかに依拠している。ＥＰＲ効果は、原発性腫瘍及び確立された転移の優先的な標的化を可能とするが、未だに血管形成していない微小転移巣に対しては有効性に乏しい（６）。適切な腫瘍関連抗原を標的化することは、散剤性の新生物性細胞への薬物送達を可能とするが、新生物性細胞の遺伝子不安定性のために（９）、根絶よりもむしろ腫瘍の編集を結果としてもたらすことがある（７、８）。代替的な急成長している戦略は、原発性腫瘍、転移、及び前転移ニッチを特徴付ける遺伝学的に安定な腫瘍間質細胞への治療剤の送達である（１０）。腫瘍微環境中の骨髄細胞は興味深い標的であり、その理由は、それらは腫瘍集団の大きい割合を占め、がん細胞の生存及び転移を促進し（１１～１６）、免疫保護を提供し、かつ腫瘍進行の間の早期に原発性腫瘍及び前転移ニッチに動員される（１７）からである。重要なことに、腫瘍浸潤性骨髄細胞（ＴＩＭＣ；骨髄由来抑制細胞－ＭＤＳＣ、腫瘍関連マクロファージ－ＴＡＭ、好中球、及び単球を含む）は、それらをそれらの全身性対応物から区別する独特の活性化された、腫瘍促進性表現型を発現する（１８～２２）。ＴＩＭＣ上に発現されるがそれらの循環性対応物上には発現されないマーカーは未だに充分に定義されていないため、我々は教師なしのアプローチを使用して、既知及び未知のＴＩＭＣ特異的エピトープに対するＲＮＡアプタマーを生成した（２３）。
【０００５】
ＲＮＡアプタマーは組織の深くに透過し、非免疫原性であり、かつ生産並びに向上した薬物動態及び安定性のための操作が容易である。さらには、これらの試薬は、標的細胞中に急速に内部移行するように選択することができ（２４）、そのため所望の細胞中への特異的な薬物（例えば、ＲＮＡ治療剤又は小分子）吸収を可能とする。そして、標的細胞中の異なるエピトープにそれぞれが結合するアプタマーの併用は、全体的な特異性を増加させ、かつ選択された組織における薬物送達を最大化するはずである。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
腫瘍浸潤性骨髄細胞に対して特異的なポリクローナルアプタマーの選択。それぞれ腫瘍浸潤性及び脾臓骨髄細胞の代理としてＩＬ４を用いて処理されたか又は非処理のままとしたＭＳＣ２細胞に対してＨＴ－細胞ＳＥＬＥＸを行った。Ａ）対照としてのサイクル０、又はサイクル１１からのＣｙ３標識されたＲＮＡアプタマーを用いて染色されたＩＬ４処理されたＭＳＣ２のＦＡＣＳ分析。Ｂ）指し示されるライブラリーからのＣｙ３標識されたポリクローナルアプタマーを用いたＭＳＣ２又はＩＬ４処理されたＭＳＣ２のＦＡＣＳ分析。Ｃ）ＣＴ２６結腸癌（直径０．５ｃｍ）を保有するマウスの脾臓又は腫瘍からの単一細胞懸濁液を、ポリクローナルアプタマーライブラリーを用いて染色し、ＣＤ１１ｂ、Ｇｒ１、Ｆ４／８０、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４、及びＣＤ８に対する抗体を用いて対比染色した。データは、それぞれの代表的な１つの実験に由来した。
腫瘍浸潤性骨髄細胞に対して特異的なモノクローナルアプタマーの同定。Ａ）４Ｔ１腫瘍（直径０．５ｃｍ）を保有する３匹のマウスからプールされたマウスの脾臓及び腫瘍からの単一細胞懸濁液を、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ６Ｃ、Ｌｙ６Ｇに対する抗体及びＡＰＴＡＮＩにより同定された１５個のＣｙ３標識されたモノクローナルアプタマーを用いて標識した。データは、ｎ＝５の生物学的複製物に由来し、かつｎ＝２の独立した実験に由来した。アプタマー３、６、１１、及び１４をさらなる分析のために選択し、太字としている。一元配置ＡＮＯＶＡ及び無関連のアプタマーに対する事後ホルム－シダック比較により＊＝Ｐ＜０．００１。ＣＤ１１ｂ－細胞においてバックグラウンド染色のみが観察された。Ｂ）アプタマー３、６、１１、及び１４の二次構造。ＡＰＴＡＮＩにより同定された結合モチーフに黒の下線を引いている。フッ素化ヌクレオチドを灰色で強調している。Ｃ）アプタマーの等モル混合物は腫瘍浸潤性骨髄細胞に対する特異性を増加させる。４Ｔ１保有マウスからの腫瘍又は脾臓のプールされた単一細胞懸濁液をアプタマー３、６、１１、１４、又は各アプタマーの等モル混合物を用いて標識し、ＦＡＣＳにより分析した。データはｎ＝３の独立した実験に由来した。
腫瘍浸潤性骨髄細胞に対して特異的なモノクローナルアプタマーの同定。Ａ）４Ｔ１腫瘍（直径０．５ｃｍ）を保有する３匹のマウスからプールされたマウスの脾臓及び腫瘍からの単一細胞懸濁液を、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ６Ｃ、Ｌｙ６Ｇに対する抗体及びＡＰＴＡＮＩにより同定された１５個のＣｙ３標識されたモノクローナルアプタマーを用いて標識した。データは、ｎ＝５の生物学的複製物に由来し、かつｎ＝２の独立した実験に由来した。アプタマー３、６、１１、及び１４をさらなる分析のために選択し、太字としている。一元配置ＡＮＯＶＡ及び無関連のアプタマーに対する事後ホルム－シダック比較により＊＝Ｐ＜０．００１。ＣＤ１１ｂ－細胞においてバックグラウンド染色のみが観察された。Ｂ）アプタマー３、６、１１、及び１４の二次構造。ＡＰＴＡＮＩにより同定された結合モチーフに黒の下線を引いている。フッ素化ヌクレオチドを灰色で強調している。Ｃ）アプタマーの等モル混合物は腫瘍浸潤性骨髄細胞に対する特異性を増加させる。４Ｔ１保有マウスからの腫瘍又は脾臓のプールされた単一細胞懸濁液をアプタマー３、６、１１、１４、又は各アプタマーの等モル混合物を用いて標識し、ＦＡＣＳにより分析した。データはｎ＝３の独立した実験に由来した。
腫瘍浸潤性骨髄細胞に対して特異的なモノクローナルアプタマーの同定。Ａ）４Ｔ１腫瘍（直径０．５ｃｍ）を保有する３匹のマウスからプールされたマウスの脾臓及び腫瘍からの単一細胞懸濁液を、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ６Ｃ、Ｌｙ６Ｇに対する抗体及びＡＰＴＡＮＩにより同定された１５個のＣｙ３標識されたモノクローナルアプタマーを用いて標識した。データは、ｎ＝５の生物学的複製物に由来し、かつｎ＝２の独立した実験に由来した。アプタマー３、６、１１、及び１４をさらなる分析のために選択し、太字としている。一元配置ＡＮＯＶＡ及び無関連のアプタマーに対する事後ホルム－シダック比較により＊＝Ｐ＜０．００１。ＣＤ１１ｂ－細胞においてバックグラウンド染色のみが観察された。Ｂ）アプタマー３、６、１１、及び１４の二次構造。ＡＰＴＡＮＩにより同定された結合モチーフに黒の下線を引いている。フッ素化ヌクレオチドを灰色で強調している。Ｃ）アプタマーの等モル混合物は腫瘍浸潤性骨髄細胞に対する特異性を増加させる。４Ｔ１保有マウスからの腫瘍又は脾臓のプールされた単一細胞懸濁液をアプタマー３、６、１１、１４、又は各アプタマーの等モル混合物を用いて標識し、ＦＡＣＳにより分析した。データはｎ＝３の独立した実験に由来した。
選択されたＲＮＡアプタマーは、再発性ＨＮＳＣＣを有する患者からの循環性骨髄細胞よりもヒトＴＩＭＣを優先的に認識した。Ａ）再発性ＨＮＳＣＣを有する患者（ｎ＝３）の血液及び腫瘍からの単一細胞懸濁液を、ＡＦ６４７標識されたアプタマー、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１２４抗体、及びｚｏｍｂｉｅバイタル色素を用いて染色し、フローサイトメトリーにより分析した。Ｂ）イメージサイトメトリー：サルベージ手術を受けているＨＮＳＣＣを有する患者（ｎ＝５）からのパラフィン包埋腫瘍検体を、Ｃｙ３標識されたアプタマー、ＦＩＴＣ－抗ＣＤ３３抗体、及びＤＡＰＩの等モル混合物を用いて染色し、「腫瘍区画」又は「健常組織区画」及びＣＤ３３＋又はＣＤ３３－細胞のいずれかでのゲーティング後に細胞プロファイラー及びＦＣＳ－ｅｘｐｒｅｓｓＶ６により分析した。アプタマーＭＦＩを、対応する関心対象の領域中の全ての細胞のＭＦＩに対して正規化した。約１０
6
及び１０
5
個の細胞をそれぞれ「腫瘍区画」又は「健常組織区画」において分析した。有意な対応のあるＴ検定を報告する。
腫瘍浸潤性骨髄細胞を優先的に認識するアプタマーの特徴。Ａ）ＩＬ４処理されたＭＳＣ２細胞に対するアプタマーの親和性をＦＡＣＳにより決定した。アプタマーベースの免疫沈降、ＳＤＳｐａｇｅ、及び質量分析を介して推定上の標的（ＡＮＸＡ４及びＶＩＭ）を同定した。エポキシビーズにコンジュゲートした組換えタンパク質に対するＦＡＣＳによりリガンドに対するＫｄを決定した。Ｂ）ＡＮＸＡ４又は無関連のタンパク質とコンジュゲートしたエポキシビーズを、Ｃｙ３標識されたアプタマー３又は無関連のアプタマーを用いて染色し、ＦＡＣＳにより分析した。Ｃ）ビメンチン又は無関連のタンパク質とコンジュゲートしたエポキシビーズを、Ｃｙ３標識されたアプタマー１１又は無関連のアプタマーを用いて染色し、ＦＡＣＳにより分析した。Ｄ）ＡＮＸＡ４競合アッセイ。５×１０
5
個のＩＬ４処理されたＭＳＣ２を、組換えＡＮＸＡ４の存在又は非存在下でアプタマー３を用いて染色した。Ｅ）ビメンチンに対するｓｈＲＮＡ又はスクランブル化ｓｈＲＮＡを有する４ＰＤナノ粒子を介してＭＣＳ２細胞へのトランスフェクトを行った。４日後に、Ｃｙ３標識されたアプタマー１１及びＤＡＰＩを用いて細胞を染色した。Ｐａ＝一元配置ＡＮＯＶＡのｐ値。データはｎ＝２の独立した実験に由来した。
アプタマーはインビボで腫瘍間質を優先的に標的化する。Ａ）アプタマーはインビボで腫瘍を標的化する。４Ｔｌ－ルシフェラーゼ乳癌を保有するマウスの静脈内に、ＡＦ７５０ストレプトアビジンとコンジュゲートしたビオチン化されたアプタマー３、６、１１、及び１４の等モル混合物を注射した。Ｂ）２ｈ後にＩＶＩＳにより体内分布を評価した。Ｃ）ＩＶＩＳにより行った経時的分析又はアプタマー体内分布。Ｄ）４Ｔ１乳癌を保有するマウス（ｎ＝５）に、ＡＦ－６４７ストレプトアビジンに搭載したアプタマー３、６、１１、及び１４をｉ．ｖ．で注射した。２時間後に、指し示される臓器を回収し、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ１１ｃ、及びＣＤ３に対する抗体を用いて対比染色した。Ｅ、Ｆ）マウス（ｎ＝５）をＤにおけるように治療し、ＣＤ１１ｂ、Ｆ４／８０、Ｌｙ６Ｃ、及びＬｙ６Ｇに対する抗体を用いて単一細胞懸濁液を対比染色した後の異なる時点においてフローサイトメトリーによりアプタマー分布を評価した。＊＝１元配置Ａｎｏｖａｐ＜０．００１。
ＴＩＭＣ特異的アプタマーは腫瘍部位においてドキソルビシン濃度を増加させる。Ａ）ＧＣリッチテイルを用いて３’末端を伸長させることによりＴＩＭＣ特異的アプタマーをドキソルビシンにコンジュゲートさせた。Ｂ）ＴＩＭＣアプタマー等モル混合物のモル比を増加させた（上から下に：０、０．００８、０．０１６、０．０３２、０．０６２、０．１２５、０．２５、及び０．５当量）ドキソルビシン溶液（１．５μＭ）の蛍光スペクトル。挿入図：アプタマー滴定についてのＨｉｌｌプロット（Ｋｄ＝０．１６当量；６．２のｄｏｘ分子／アプタマー）。Ｃ）ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）に４Ｔ１乳癌を同所性（４Ｔ１＿ｏ；原発性腫瘍：乳房、転移：肺）又は静脈内（４Ｔ１＿ｉｖ；肺及び肝臓中の転移）に負荷した。マウスの追加の群に、非転移性の４Ｔ１由来の細胞系６７ＮＲを同所性に負荷した（原発性腫瘍のみ）。１０日後、ＴＩＭＣ特異的アプタマーとコンジュゲートしたドキソルビシン（０．３５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内に用いてマウスを治療した。２４ｈ後にドキソルビシン体内分布を評価した。データはそれぞれの代表的な１つの実験に由来した。Ｄ）遊離ドキソルビシン又はＴＩＭＣ特異的若しくは対照アプタマーを介して与えたドキソルビシンの体内分布。第３乳腺中に４Ｔ１乳癌（直径０．５ｃｍ）を保有するマウス（ｎ＝５）にｉ．ｖ．で、遊離ドキソルビシン（Ｄｏｘｈｉｇｈ３．５ｍｇ／ｋｇ）、ＴＩＭＣ－アプタマー複合化ドキソルビシン（ＴＩＭＣａｐｔ；０．３５ｍｇ／ｋｇ）又は無関連のアプタマー（Ｉｒｒ．Ａｐｔ）複合化ドキソルビシンを与えた。２４ｈ後に組織中のドキソルビシンを酸アルコール抽出後の分光法により定量化した。データはそれぞれの代表的な１つの実験に由来した。ｄｏｘｈｉｇｈ群に対する多重一対比較（ホルム－シダックの方法）において＊＝ｐ＜０．０５。
ＴＩＭＣ特異的アプタマーはドキソルビシン治療指数を増加させる。Ａ）第３乳腺中に４Ｔ１腫瘍を保有するマウスを遊離ドキソルビシン（３．５ｍｇ／ｋｇ若しくは０．３５ｍｇ／ｋｇ）、Ｄｏｘｉｌ（０．３５ｍｇ／ｋｇ）、又はＴＩＭＣ特異的アプタマーミックスにコンジュゲートしたドキソルビシン（０．３５ｍｇ／ｋｇ）を用いてｉ．ｖ．で治療した。追加の対照は、ドキソルビシンとコンジュゲートした無関連のアプタマー、コンジュゲートしていないＴＩＭＣ特異的アプタマー、及び非治療のマウスを含んだ。治療を２及び６日後に繰り返した。腫瘍指数が１．２ｃｍ
2
に達したときにマウスを安楽死させた。ログランク及び事後多重比較分析（ホルム－シダックの方法）を報告する。毒性の度合いとして体重損失を報告する。Ｃ）４Ｔｌｗｔ乳がん又はドキソルビシン耐性バリアントｄｏｘ耐性４Ｔ１を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを負荷した。腫瘍が直径０．５ｃｍに達したときに、マウスをＴＩＭＣ特異的アプタマーを用いて治療するか、又は非治療のままとした。生存をモニターした。
アプタマーは有効にＣＣＲ１及び５つのｓｉＲＮＡを腫瘍浸潤性骨髄細胞に送達し、腫瘍進行を遅延させる。Ａ）アプタマー／ｓｉＲＮＡキメラの構造。Ｂ）４Ｔ１乳癌を同所性に用いてＢａｌｂ／ｃマウスを負荷し、負荷の５、７、９、１２、１４、１６及び１９日後にスクランブル化ｓｉＲＮＡ（黒バー）又はＣＣＲ１及びＣＣＲ５に対するｓｉＲＮＡ（３０ピコモル、白バー）を搭載したアプタマーを静脈内に用いて治療した。腫瘍浸潤性骨髄細胞に対する最後の治療の６日後にＣＣＲ１及びＣＣＲ５ｍＲＮＡについてのｑＲＴ－ＰＣＲを行った。Ｃ）負荷の２５日後の腫瘍サイズ。
ＩＬ４処理されたＭＳＣ２又はそれらの推定上のリガンドに対するアプタマー＃３、＃６、＃１１及び＃１４の親和性。Ａ）１０
5
個のＩＬ４処理されたＭＳＣ２を、異なる濃度の指し示されるＣｙ３標識されたアプタマーを用いて染色した。結合をＦＡＣＳにより評価した。Ｂ）異なる濃度のＣｙ３標識されたアプタマー＃３及びアプタマー＃４を使用して、それぞれ組換えＡＮＸＡ４又は組換えＶＩＭとコンジュゲートしたエポキシビーズを染色した。ＩＬ４Ｒａに対するＣｙ３標識されたアプタマーを無関連の対照として使用した。結合をＦＡＣＳにより評価した。データは３つの独立した実験に由来した。
ＡＰＴＡＮＩを用いて選択された１５個のアプタマーのクラスター分析。ＡＰＴＡＮＩを用いて選択された１５個のモノクローナルアプタマーの可変領域を、ｃｌｕｓｔａｌ－Ω、及びデフォルトのパラメーターを使用してＪａｉｌｖｉｅｗを用いて生成された近隣結合ツリーを用いてアライメントした。
少なくとも０．１％の富化及び少なくとも３つのモチーフ又は０．１％より高い頻度を有する少なくとも１つのモチーフの存在に基づいてＡＰＴＡＮＩにより選択された１５個のアプタマーの配列、頻度、及びモチーフ。
実施例において使用されたオリゴヌクレオチド。
実施例において使用されたマウス及びヒト抗体のリスト。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本開示は、異なる前臨床モデルにわたり、及びより重要なことにヒトにおいて、腫瘍浸潤性骨髄細胞（ＴＩＭＣ）を特異的に認識するＲＮＡアプタマーの発見に部分的に基づく。
【０００８】
全身性の化学療法は依然としてがん療法のための最も重要な治療の１つであるが、この治療オプションの使用に対して制限を課す全身性の副作用、例えば心毒性及び重度の好中球減少がある（３８）。追加的に、化学療法は、がん生存者の生活の質を減少させる長期罹病率を誘導する。
【０００９】
腫瘍浸潤性骨髄細胞の腫瘍促進性活性化型表現型を物理的に標的化することにより化学療法剤又は他の治療剤（例えば、ＲＮＡ治療剤）を腫瘍中及び転移部位中に濃縮させることができる新たなモードが本明細書に記載される。骨髄細胞は、いくつかの種類のマウス及びヒトがんの間質中に最も豊富に存在する先天免疫細胞である（３９～４１）。ヒト腫瘍中の骨髄細胞の存在は、血管密度の増加、より高い転移性拡大、及びより不良の臨床アウトカムと相関し、それらの存在は腫瘍進行のために必要である（４２、４３）。腫瘍部位において、骨髄細胞は、それらをそれらの全身循環性細胞対応物から区別し、かつそれらの免疫抑制性、寛容原性、及び腫瘍促進性の役割のために必要な独特の抗原性プロファイル及び機能的な特徴を獲得する（２０、４４、４５）。骨髄細胞が腫瘍進行又は新生物性細胞とのそれらの相互作用を促進するために用いる機構を阻害するための多くのアプローチが試験されているが（４６～４８）、我々の知る限り、腫瘍浸潤性骨髄細胞及び循環性骨髄細胞を識別することができる試薬は未だに利用可能ではない。さらには、マウスにおいて腫瘍関連及び循環性の両方のＭＤＳＣに結合することができるアプタマー及びペプチドが単離され（４９～５１）、ＭＤＳＣ枯渇のため（５０、５１）又はＤｏｘｉｌ送達を向上させるため（４９）に用いられたが、これらの試薬は腫瘍浸潤性骨髄細胞を優先的に認識しない。実際に、Ｄｏｘｉｌ送達のために使用された場合、心臓並びに脾臓及び肝臓中でのＤｏｘの重要な蓄積が認められた（４９）。
【００１０】
使用された腫瘍モデル又はマウス系統にかかわらず腫瘍浸潤性骨髄細胞に対して特異的であるがそれらの循環性対応物には特異的でない４つのＲＮＡアプタマー（アプタマー３、６、１１、及び１４、図２）が単離された。興味深いことに、アプタマー３及びアプタマー１１はそれらのリガンドとしてそれぞれＡＮＸＡ４及びビメンチンを有する。ビメンチンは、単球分化及び活性酸素種の産生において鍵となる役割を果たし、炎症促進性刺激の下で、活性化マクロファージの膜に移行する（５２～５６）。実際に、ビメンチンは異なるがんの腫瘍間質中に存在するが、培養された腫瘍細胞中での発現は乏しい（５４～５６）。機能的に、このタンパク質は上皮間葉移行及び転移に関与している（５７）。ＡＮＸＡ４は、膜融合及びエキソサイトーシスを促進するカルシウム依存性のリン脂質結合性タンパク質である（５８）。それは活性化ＭＤＳＣ、ＴＩＭＣ、及び活性化Ｍ２マクロファージにおいて過剰発現される（４４、５９）。休止マクロファージの細胞質中に局在化するが、ＡＮＸＡ４は活性化の間に膜に移行する（６０、６１）。両方のタンパク質はヒト悪性腫瘍中に発現され、それらの発現は、ＴＣＧＡデータ及びＰｒｏｔｅｉｎＡｔｌａｓによれば腎臓がん、乳がん及び卵巣がんにおけるより不良な予後と相関する。そのため、両方の同定された標的は、ＴＩＭＣ活性化表現型に対するアプタマーの特異性をサポートする。
（【００１１】以降は省略されています）

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