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公開番号2025061557
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-04-10
出願番号2025008660,2022163391
出願日2025-01-21,2015-03-04
発明の名称標的化したDNA配列の核酸塩基を特異的に変換するゲノム配列の改変方法及びそれに用いる分子複合体
出願人国立大学法人神戸大学
代理人個人,個人,個人
主分類C12N 15/09 20060101AFI20250403BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】二本鎖DNAを無切断もしくは一本鎖切断により遺伝子の特定配列の核酸塩基を改変する、新規なゲノム編集の手法、並びにそのための核酸配列認識モジュール及び核酸塩基変換酵素の複合体を提供する。
【解決手段】選択された二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素とが結合した複合体を、該二本鎖DNAと接触させ、該標的化された部位において該二本鎖DNAの両方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の1以上のヌクレオチドを他の1以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に1以上のヌクレオチドを挿入する工程を含み、該核酸配列認識モジュールが、Casの両方のDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステムである、方法を提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
実施例に記載の発明。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNAの二重鎖切断を伴わず（無切断もしくは一本鎖切断で）、また外来DNA断片の挿入を行わずにゲノムの特定領域内の核酸塩基の改変を可能とする、ゲノム配列の改変方法及びそれに用いる、核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素との複合体に関する。
続きを表示（約 6,700 文字）【背景技術】
【０００２】
近年、様々な生物種において目的の遺伝子・ゲノム領域を改変する技術として、ゲノム編集が注目されている。従来、ゲノム編集の手法としては、配列非依存的なDNA切断能を有する分子と配列認識能を有する分子とを組み合わせた人工ヌクレアーゼを利用する方法が提案されている（非特許文献１）。
例えば、ジンクフィンガーDNA結合ドメインと非特異的なDNA切断ドメインとを連結した、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）を用い、宿主の植物細胞または昆虫細胞にDNA中の標的遺伝子座において組換えを行う方法（特許文献１）、植物病原菌キサントモナス属が有するDNA結合モジュールである転写活性化因子様（TAL）エフェクターと、DNAエンドヌクレアーゼとを連結したTALENを用いて、特定のヌクレオチド配列内又はそれに隣接する部位で、標的遺伝子を切断・修飾する方法（特許文献２）、あるいは、真正細菌や古細菌が持つ獲得免疫システムで機能するDNA配列CRISPR（ClusteredRegularlyinterspacedshort palindromic repeats）と、CRISPRとともに重要な働きを持つヌクレアーゼCas（CRISPR-associated）タンパク質ファミリーとを組み合わせたCRISPR-Cas9システムを利用する方法（特許文献３）などが報告されている。さらには、35個のアミノ酸からなり1個の核酸塩基を認識するPPRモチーフの連続によって、特定のヌクレオチド配列を認識するように構成されたPPRタンパク質と、ヌクレアーゼとを連結した人工ヌクレアーゼを用い、該特定配列の近傍で標的遺伝子を切断する方法（特許文献４）も報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
特許第4968498号公報
特表2013-513389号公報
特表2010-519929号公報
特開2013-128413号公報
【非特許文献】
【０００４】
Kelvin M Esvelt, Harris H Wang (2013) Genome-scaleengineeringforsystems and synthetic biology, Molecular Systems Biology 9: 641
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これまで提案されてきたゲノム編集技術は、基本的にDNA二重鎖切断（double-stranded
DNA breaks : DSB）を前提としているが、想定外のゲノム改変を伴うため、強い細胞毒性や染色体の転位などの副作用があり、遺伝子治療における信頼性を損なったり、ヌクレオチド改変による生存細胞数が極めて少なかったり、霊長類卵細胞や単細胞微生物では遺伝子改変自体が困難であるといった共通の課題があった。
従って、本発明の目的は、DSBないし外来DNA断片の挿入を伴わずに、即ち、二本鎖DNAを無切断もしくは一本鎖切断により遺伝子の特定配列の核酸塩基を改変する、新規なゲノム編集の手法、並びにそのための核酸配列認識モジュール及び核酸塩基変換酵素の複合体
を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、DSBを伴うことなく、DNA塩基の変換反応による塩基変換を採用することを着想した。DNA塩基の脱アミノ化反応による塩基変換反応自体は既に知られているが、これをDNAの特定の配列を認識させて任意の部位を標的化し、DNA塩基の塩基変換により標的化されたDNAを特異的に改変することは未だ実現されていない。
そこで、このような核酸塩基の変換を行う酵素として脱アミノ化反応を触媒するデアミナーゼを用い、これとDNA配列認識能のある分子とを連結させることにより、特定のDNA配列を含む領域における核酸塩基変換によるゲノム配列の改変を行った。
具体的には、CRISPR-Casシステム（CRISPR-変異Cas）を用いて行った。即ち、改変しようとする遺伝子の標的配列と相補的な配列を含むゲノム特異的CRISPR-RNA:crRNA（gRNA）に、Casタンパク質をリクルートするためのRNA（trans-activatingcrRNA:tracrRNA）を連結したRNA分子をコードするDNAを作製し、他方で二本鎖DNAのいずれか一方もしくは両方の鎖の切断能を失活した変異Casタンパク質をコードするDNA（dCas）とデアミナーゼ遺伝子を連結したDNAを作製し、これらのDNAを、改変しようとする遺伝子を含む宿主酵母細胞に導入した。その結果、標的配列を含む目的遺伝子の数百ヌクレオチドの範囲内で、ランダムに変異を導入することに成功した。二本鎖DNAのいずれのDNA鎖をも切断しない二重変異Casタンパク質を用いた場合に比べ、いずれか一方の鎖を切断する変異Casタンパク質を用いた場合の方が、変異導入効率は上昇した。また、DNA二重鎖のいずれを切断するかによって、変異領域の広さと変異の多様性が変化することが明らかとなった。さらに、目的遺伝子内の複数の領域を標的化することにより、きわめて効率よく変異を導入することに成功した。即ち、DNAを導入した宿主細胞を非選択培地に播種し、無作為に選んだコロニーについて目的遺伝子の配列を調べた結果、ほとんど全てのコロニーについて変異が導入されていることを確認した。また、2以上の目的遺伝子中のある領域をそれぞれ標的化することにより、複数箇所のゲノム編集を同時に行えることも確認した。さらに、当該方法は、二倍体以上の倍数体ゲノムの対立遺伝子に同時に変異を導入することができることや、真核細胞のみならず、大腸菌のような原核細胞においても変異を導入することができ、生物種を問わず広く適用可能であることも実証した。また、核酸塩基変換反応を所望の時期に一過的に行うことにより、これまで効率の低かった必須遺伝子の編集を効率よく行えることも見出した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明は以下の通りである。
［１］二本鎖DNAの標的化された部位を改変する方法であって、選択された二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素とが結合した複合体を、該二本鎖DNAと接触させ、該標的化された部位において該二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する工程を含む、方法。
［２］前記核酸配列認識モジュールが、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステム、ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター及びPPRモチーフからなる群より選択される、上記［１］記載の方法。
［３］前記核酸配列認識モジュールが、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステムである、上記［１］記載の方法。
［４］異なる標的ヌクレオチド配列とそれぞれ特異的に結合する、２種以上の核酸配列認識モジュールを用いることを特徴とする、上記［１］～［３］のいずれかに記載の方法。［５］前記異なる標的ヌクレオチド配列が、異なる遺伝子内に存在する、上記［４］記載
の方法。
［６］前記核酸塩基変換酵素がデアミナーゼである、上記［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記デアミナーゼがAID（AICDA）である、上記［６］記載の方法。
［８］二本鎖DNAと複合体との接触が、該二本鎖DNAを有する細胞への、該複合体をコードする核酸の導入により行われる、上記［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記細胞が原核生物細胞である、上記［８］記載の方法。
［１０］前記細胞が真核生物細胞である、上記［８］記載の方法。
［１１］前記細胞が微生物細胞である、上記［８］記載の方法。
［１２］前記細胞が植物細胞である、上記［８］記載の方法。
［１３］前記細胞が昆虫細胞である、上記［８］記載の方法。
［１４］前記細胞が動物細胞である、上記［８］記載の方法。
［１５］前記細胞が脊椎動物細胞である、上記［８］記載の方法。
［１６］前記細胞が哺乳類動物細胞である、上記［８］記載の方法。
［１７］前記細胞が倍数体細胞であり、相同染色体上のすべての標的化された対立遺伝子内の部位を改変することを特徴とする、上記［９］～［１６］のいずれかに記載の方法。［１８］前記複合体をコードする核酸を、発現期間を制御可能な形態で含む発現ベクターを、前記細胞に導入する工程、及び
二本鎖DNAの標的化された部位の改変が固定されるのに必要な期間、該核酸の発現を誘導する工程、
を含む、上記［８］～［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９］二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列が、前記細胞にとって必須の遺伝子内にあることを特徴とする、上記［１８］記載の方法。
［２０］二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素とが結合した複合体であって、標的化された部位において該二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する、核酸改変酵素複合体。
［２１］上記［２０］記載の核酸改変酵素複合体をコードする核酸。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のゲノム編集技術によれば、外来DNAの挿入もDNA二重鎖切断も伴わないため、安全性に優れており、従来法において遺伝子組み換えであるとして、生物学的あるいは法律的に議論があったケースにおいても、解決策となる可能性が少なからずある。また、変異導入の範囲を理論的には一塩基のピンポイントから数百塩基に至る範囲まで幅広く設定することが可能であり、これまではほとんど不可能であった特定の限定的な領域へのランダム変異導入による局所的な進化誘導にも応用できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
CRISPR-Casシステムを用いた本発明の遺伝子改変方法のメカニズムを示す模式図である。
CRISPR-Casシステムとヤツメウナギ由来のPmCDA1デアミナーゼとを組み合わせた本発明の遺伝子改変方法の効果を、出芽酵母を用いて実証した結果を示す図である。
ニッカーゼ活性を有するCas9のD10A変異体を用いたCRISPR-Cas9システムと、デアミナーゼとPmCDA1とを組み合わせた場合（nCas9D10A-PmCDA1）と、DNA二重鎖切断能を有する従来型Cas9とを用いた場合の、発現誘導後の生存細胞数の変化を示す図である。
ヒト由来のAIDデアミナーゼを用い、dCas9と、SH3ドメイン及びその結合リガンドを介して結合するように構築された発現コンストラクトを、2種のgRNA（target4及びtarget5の配列を標的とする）とともに出芽酵母に導入した結果を示す図である。
いずれかのDNA一本鎖を切断するCas9の使用により変異導入効率が上昇したことを示す図である。
二本鎖DNAを切断しない場合、いずれかのDNA一本鎖を切断する場合によって、変異導入領域の広さと頻度が変化することを示す図である。
近接する2つの領域を標的とすることによって、極めて高い変異導入効率が実現できることを示す図である。
本発明の遺伝子改変方法はマーカーによる選抜を要しないことを示す図である。配列決定したすべてのコロニーで変異が導入されていた。
本発明の遺伝子改変方法により、ゲノム中の複数箇所の同時編集が可能であることを示す図である。上段は各遺伝子の標的部位のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示し、該ヌクレオチド配列の上の矢印は標的ヌクレオチド配列を示す。矢尻もしくは矢頭の数字は、標的ヌクレオチド配列末端のORF上の位置を示す。下段は赤色（R）及び白色（W）コロニー各5クローンにおける標的部位のシーケンス結果を示している。配列中、白抜き文字で示したヌクレオチドにおいて塩基変換が起こっていることを示す。尚、カナバニンへの応答性（Can
R
）は、Rは耐性、Sは感受性を示す。
本発明の遺伝子改変方法により、二倍体ゲノムの相同染色体上の両方の対立遺伝子に同時に変異を導入できることを示す図である。図１０Ａは、ade1遺伝子（上パネル）及びcan1遺伝子のそれぞれについてのホモ変異導入効率を示し、図１０Ｂは、赤色コロニーでは実際にホモ変異が導入されていることを示す（下パネル）。また、白色コロニーでもヘテロ変異は生じていることが示された（上パネル）。
本発明の遺伝子改変方法により、原核細胞である大腸菌のゲノム編集が可能であることを示す図である。図１１Ａは、用いたプラスミドの模式図である。図１１Ｂは、galK遺伝子内の領域をターゲットとして、効率よく変異（CAA→TAA）が導入できたことを示す。図１１Ｃは、非選択培地（none）、25μg/mlリファンピシン（Rif25）及び50μg/mlリファンピシン（Rif50）含有培地で選抜されたコロニー各2クローンについて、シーケンス解析した結果を示す。リファンピシン耐性を賦与する変異が導入されていることが確認された（上パネル）。リファンピシン耐性株の出現頻度は10%程度と見積もられた（下パネル）。
ガイドRNAの長さによる編集塩基箇所の調節を示す図である。図１２Ａは標的ヌクレオチド配列長を20塩基とした場合と、24塩基とした場合の編集塩基部位の概念図を示す。図１２ＢはgsiA遺伝子を標的とし、標的ヌクレオチド配列長を変動させて編集を行った結果を示す。変異部位は太字でしており、「T」及び「A」はクローン内で完全に変異（C→T又はG→A）が導入されていることを示し、「t」はクローン内で50％以上の割合で変異（C→T）が導入されている（完全にクローン化されていない）ことを示し、「c」はクローン内での変異（C→T）が導入効率が50%未満であることを示す。
実施例１１で使用した変異導入用温度感受性プラスミドの模式図である。
実施例１１における変異導入のプロトコルを示す図である。
実施例１１においてrpoB遺伝子に変異を導入した結果を示す図である。
実施例１１においてgalK遺伝子に変異を導入した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、改変しようとする二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列及びその近傍のヌクレオチドを他のヌクレオチドに変換することにより、該二本鎖DNAの該標的化された部位を改変する方法を提供する。当該方法は、該二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素とが結合した複合体を、該二本鎖DNAと接触させることにより、該標的化された部位、即ち、標的ヌクレオチド配列及びその近傍のヌクレオチドを、他のヌクレオチドに変換する工程を含むことを特徴とする。
（【００１１】以降は省略されています）

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