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公開番号2025039669
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-03-21
出願番号2025001829,2021526392
出願日2025-01-06,2019-11-14
発明の名称コンパートメント特異的カーゴ送達のための組成物および方法
出願人フラッグシップパイオニアリングイノベーションズブイ, インコーポレイテッド
代理人個人
主分類C12N 5/071 20100101AFI20250313BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】フソソーム組成物および方法を提供すること。
【解決手段】本開示は、フソソームおよび膜タンパク質を標的細胞に送達するためのそれらの使用に関連する技術を提供する。幾つかの実施形態では、フソソームは、脂質二重層、脂質二重層に囲まれた内腔、フソゲン、および膜タンパク質ペイロード剤を含むカーゴを含む。幾つかの実施形態では、そのようなカーゴは、膜タンパク質をコードする(もしくはコードする核酸に相補的である)核酸であり得るか、またはそれを含み得る。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
明細書に記載の発明。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１１月１４日に出願された「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＡＮＤ
ＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＣＯＭＰＡＲＴＭＥＮＴ－ＳＰＥＣＩＦＩＣＣＡＲＧＯＤＥＬＩＶＥＲＹ」と題された米国仮出願第６２／７６７，３９４号の優先権を主張し、その内容は全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
続きを表示（約 4,900 文字）【０００２】
配列表の参照による組込み
本出願は、電子形式の配列表と共に提出されている。配列表は、２０１９年１１月１４日に作成された１８６１５２００２６４１ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴと題されたファイルとして提供され、サイズは８０７キロバイトである。配列表の電子形式の情報は、その全体が参照により組み込まれる。
【０００３】
細胞間融合は、受精、発達、免疫応答、および腫瘍形成などの多様な生物学的プロセスで必要とさf
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、フソソームおよび膜タンパク質を標的細胞に送達するためのそれらの使用に関連する技術を提供する。幾つかの実施形態では、フソソームは、脂質二重層、脂質二重層に囲まれた内腔、フソゲン、および膜タンパク質ペイロード剤を含むカーゴを含む。幾つかの実施形態では、そのようなカーゴは、膜タンパク質をコードする（もしくはコードする核酸に相補的である）核酸であり得るか、またはそれを含み得る。
【０００５】
実施形態の列挙
膜送達
１．フソソームであって、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔（例えば、細胞質ゾルを含む）と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）膜タンパク質ペイロード剤（例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する）であって、
ｉ）キメラ抗原受容体、
ｉｉ）例えば、表７から選択されるインテグリン膜タンパク質ペイロード、
ｉｉｉ）表８から選択されるイオンチャネルタンパク質、
ｉｖ）例えば、表９および１０から選択される孔形成タンパク質、
ｖ）例えば、表１１から選択されるＴｏｌｌ様受容体、
ｖｉ）例えば、表１２から選択されるインターロイキン受容体ペイロード、
ｖｉｉ）表１３～１４から選択される細胞接着タンパク質、
ｖｉｉｉ）表１７から選択される輸送タンパク質、
ｉｘ）天然に存在する膜タンパク質に対して異種であるシグナル配列、もしくは
ｘ）表６に列挙されているシグナル配列のうちの１つ以上を含むか、またはコードする膜タンパク質ペイロード剤と、を含み、
フソソームが、ヌクレオカプシドタンパク質またはウイルスマトリックスタンパク質を含まない、フソソーム。
２．フソソームであって、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔（例えば、細胞質ゾルを含む）と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）Ｔ細胞受容体を含むか、またはコードする膜タンパク質ペイロード剤（例えば、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する）と、を含み、
任意に、フソソームが、ヌクレオカプシドタンパク質またはウイルスマトリックスタンパク質を含まない、フソソーム。
３．フソソームであって、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔（例えば、細胞質ゾルを含む）と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する膜タンパク質ペイロード剤と、
を含み、
ｉ）フソソームが、細胞生物学的物質を含むか、またはそれに含まれる、
ｉｉ）フソゲンが、例えば、実施例２９のアッセイによって測定した場合、例えば、フソソームあたり少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、またはそれ以下のコピー数で存在する、
ｉｉｉ）フソソームが、例えば、実施例４３のアッセイによって測定した場合、例えば、フソソームあたり少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、またはそれ以下のコピー数で治療薬を含む、
ｉｖ）フソソームが、ＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧのうちの１つ以上が、ソース細胞における対応する脂質レベルの７５％以内である脂質を含む、
ｖ）フソソームが、例えば、実施例４２のアッセイを使用して、ソース細胞のそれと同様のプロテオミクス組成物を含む、
ｖｉ）フソソームが、例えば、実施例６３のアッセイを使用して、例えば、インスリンの不在下で陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも少なくとも１０％多い、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルの送信、例えば、インスリンに応答したＡＫＴリン酸化、またはインスリンに応答したグルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）の取込みが可能である、
ｖｉｉ）フソソームが、被験体、例えばマウスに投与された場合、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、または眼を標的とし、例えば実施例８７または１００のアッセイにより、例えば投与されたフソソームの集団中のフソソームの少なくとも０．１％または１０％が、２４時間後に標的組織内に存在する、あるいは
ｖｉｉｉ）ソース細胞が、好中球、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、またはニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択される、のうちの１つ以上である、フソソーム。
４．フソソームであって、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔（例えば、細胞質ゾルを含む）と、
（ｃ）ソース細胞に対して外因性であるか、もしくは過剰発現するフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）膜タンパク質ペイロード剤であって、
ｉ）膜タンパク質をコードするＤＮＡを含む、または
ｉｉ）ソース細胞に対して外因性であるか、もしくは過剰発現する膜タンパク質をコードするＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを含む、膜タンパク質ペイロード剤と、を含み、
フソソームが、ヌクレオカプシドタンパク質またはウイルスマトリックスタンパク質を含まない、フソソーム。
５．フソソームであって、
（ａ）ソース細胞に由来する複数の脂質を含む脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層に囲まれた内腔（例えば、細胞質ゾルを含む）と、
（ｃ）哺乳動物のフソゲンが、アルツハイマー病のβアミロイドペプチドまたはフェルチリンではない、ソース細胞に対して外因性であるか、または過剰発現する非ウイルス性、例えば、哺乳動物のフソゲンと、
【０００６】
本明細書の態様のうちのいずれか、例えば、上記のフソソーム、フソソーム組成物、調製物、および方法を、本明細書の実施形態のうちの１つ以上、例えば、本明細書に記載される実施形態のうちの１つまたはと組み合わせることができる。
【０００７】
本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【０００８】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。例えば、本明細書において、例えば、いずれかの表で言及される全てのＧｅｎＢａｎｋ、Ｕｎｉｇｅｎｅ、およびＥｎｔｒｅｚ配列は、参照により組み込まれる。特に明記されていない限り、本明細書の表を含め、本明細書で指定されている配列受託番号は、２０１８年５月１７日現在のデータベースエントリを参照している。１つの遺伝子またはタンパク質が複数の配列受託番号を参照する場合、全ての配列バリアントが含まれる。加えて、材料、方法、および実施例は、単に例示であり、限定することを意図していない。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
本発明の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとよりよく理解されるであろう。本発明を説明する目的で、ここに例示されている本明細書に記載の特定の実施形態が、本明細書に記載される。ただし、本発明は、図面に示される実施形態の正確な配置および手段に限定されないことを理解されたい。
小胞体の色素によるフソソームの染色を定量化する。
ミトコンドリアの色素によるフソソームの染色を定量化する。
リソソームの色素によるフソソームの染色を定量化する。
Ｆ－アクチンの色素によるフソソームの染色を定量化する。
ＣｒｅおよびＧＦＰを発現するフソゲンと接触した細胞を光退色させた後のＧＦＰ蛍光の回復を示すグラフ。
フソソームまたは陰性対照と接触した後、ＲＦＰを発現している標的細胞のパーセンテージを示すグラフ。
ドナーとレシピエントのＨｅＬａ細胞との間の融合による陽性のオルガネラ送達の画像。白色で示された細胞内領域は、ドナーとレシピエントのミトコンドリアとの間の重複を示す。灰色の細胞内領域は、ドナーおよびレシピエントのオルガネラが重なっていない場所を示す。
ドナーとレシピエントのＨｅＬａ細胞との間の融合による陽性のオルガネラ送達の画像。白色で示された細胞内領域は、ドナーとレシピエントのミトコンドリアとの間の重複を示す。灰色の細胞内領域は、ドナーおよびレシピエントのオルガネラが重なっていない場所を示す。
フソソームを注射したマウスからの示された組織の顕微鏡画像を示す。白色は、ＲＦＰ蛍光細胞を表し、インビボでの細胞へのタンパク質カーゴの送達を示す。
標的細胞によるルシフェラーゼの発現をもたらす、指定された投与経路によるインビボでのマウス組織へのフソソームの送達の成功を示す一連の画像。
マウスの筋肉組織におけるｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の顕微鏡画像を示し、細胞生物学による筋肉細胞へのタンパク質カーゴの送達を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、膜タンパク質ペイロード剤を含むフソソーム、および関連する方法を記載する。
（【００１１】以降は省略されています）

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