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公開番号2025016506
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-02-04
出願番号2024177888,2021540046
出願日2024-10-10,2020-01-09
発明の名称二本鎖RNA及びその使用
出願人ウニベルシダージデコインブラ,UNIVERSIDADE DE COIMBRA,セントロデネウロシエンシアスエビオロジアセルラル,CENTRO DE NEUROCIENCIAS E BIOLOGIA CELULAR
代理人個人,個人
主分類C12N 15/113 20100101AFI20250128BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】マカド-ジョゼフ病(MJD)のための、二本鎖RNA及びその使用方法を提供する。
【解決手段】本開示は、顕性の機能獲得型変異アタキシン-3タンパク質をコードするアタキシン-3遺伝子におけるエキソン一塩基多型(SNP)に対するRNAサイレンシング技術(例えば、RNA干渉)を使用する。この目的のための、MJDを引き起こす伸長と連鎖不平衡の関係にあるSNPに対して相補的なアンチセンス配列を有する、非常に標的特異的な遺伝子サイレンシングRNAを提供する。前記二本鎖RNAを中枢神経系(CNS)に送達することができる遺伝子送達用ベクターとして選択されたアデノ随伴ウイルスベクター、特に、アデノ随伴ウイルスベクター血清型9(AAV9)も併せて提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
実質的に相補的なセンスリボヌクレオチド配列との間で塩基対を形成したアンチセンス
リボヌクレオチド配列
を含む、リボ核酸（ＲＮＡ）分子であって、
アンチセンスＲＮＡ配列の各リボヌクレオチドが、変異ヒトアタキシン－３遺伝子のマ
カド－ジョゼフ病（ＭＪＤ）アレルと連鎖不平衡の関係にある一塩基多形を含む、対応す
る変異ヒトアタキシン－３のリボヌクレオチドに対して相補的であり、
変異ヒトアタキシン－３ｍＲＮＡの一塩基多型に対して相補的なアンチセンスＲＮＡ
配列のリボヌクレオチドが、アンチセンスＲＮＡ配列の５’末端のリボヌクレオチドから
リボヌクレオチド１０個分離れている、
リボ核酸（ＲＮＡ）分子。
続きを表示（約 690 文字）【請求項２】
塩基対を形成したセンスリボヌクレオチド配列が、アンチセンスリボヌクレオチド配列
に対して完全に相補的ではない、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
【請求項３】
アンチセンスリボヌクレオチド配列が、センスリボヌクレオチド配列に対して少なくと
も９０％相補的である、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
【請求項４】
アンチセンスリボヌクレオチド配列が、配列番号１又は１３に対して相補的である、請
求項１に記載のＲＮＡ分子。
【請求項５】
アンチセンスリボヌクレオチド配列が、配列番号２、３、４、５、６、１４、１５、１
６、１７又は１８である、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
【請求項６】
アンチセンスリボヌクレオチド配列が、配列番号２である、請求項１に記載のＲＮＡ分
子。
【請求項７】
アンチセンスＲＮＡ配列の５’末端及び３’末端のリボヌクレオチドが、少なくともリ
ボヌクレオチド１７個分離れている、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
【請求項８】
アンチセンスＲＮＡ配列の５’末端及び３’末端のリボヌクレオチドが、リボヌクレオ
チド１７～２１個分離れている、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
【請求項９】
ＲＮＡ分子が、単一のＲＮＡ分子である、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
【請求項１０】
ＲＮＡ分子が、ｍｉＲＮＡである、請求項７に記載のＲＮＡ分子。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本開示は、特にマカド－ジョゼフ病（ＭＪＤ）のための、アレル特異的な非侵襲性の処
置に関する。本開示は、顕性の機能獲得型変異アタキシン－３タンパク質をコードするア
タキシン－３遺伝子におけるエキソン一塩基多型（ＳＮＰ）に対するＲＮＡサイレンシン
グ技術（例えば、ＲＮＡ干渉）を使用し、これにより、効果的なＭＪＤの処置をもたらす
。この目的のために、上記疾患を引き起こす伸長と連鎖不平衡の関係にあるＳＮＰに対し
て相補的なアンチセンス配列を有する、非常に標的特異的な遺伝子サイレンシングＲＮＡ
を設計し、試験した。
続きを表示（約 3,300 文字）【０００２】
さらに、本開示は、遺伝子送達用ベクターとして選択されたアデノ随伴ウイルスベクタ
ー、特に、アデノ随伴ウイルスベクター血清型９（ＡＡＶ９）にも関するが、この特定の
血清型は血液脳関門（ＢＢＢ）を効率的に通過するため、侵襲性が最小限の経路（例えば
、静脈内投与）によって、前記二本鎖ＲＮＡを中枢神経系（ＣＮＳ）に送達することがで
きる。
【背景技術】
【０００３】
マカド－ジョゼフ病（ＭＪＤ）は、小脳機能障害及び運動協調性の喪失を特徴とする常
染色体顕性神経変性障害である。この障害は、世界中で最も一般的な種類の脊髄小脳失調
症に相当するものであるが、アタキシン－３遺伝子（ＭＪＤ１／ＡＴＸＮ３遺伝子）のコ
ード領域における遺伝子変異によって引き起こされる。この遺伝子変異には、ＣＡＧトリ
ヌクレオチドリピートとして知られた、アタキシン－３遺伝子のＤＮＡセグメントを要す
る。通常、人間のアタキシン－３遺伝子中のＣＡＧセグメントは、複数回、すなわち、約
１０～４２回繰り返されている。ＭＪＤを発症する人々は、少なくとも１つのアレルにお
いて、ＣＡＧリピートの数が増加している。発症者には通常、発症した片方の親から変異
アレルが遺伝している。５１超のＣＡＧリピートを有する人々には、ＭＪＤの徴候及び症
状を発症する可能性があるが、６０以上のリピートを有する人々は、ほぼ必ず障害を発症
する。ＣＡＧリピートのサイズが増大すると、細長い（変異した）アタキシン－３タンパ
ク質が生成される。このタンパク質は細胞内で処理されて、ニューロン内に蓄積及び凝集
する細胞傷害性のより小さいフラグメントになる。これは、複数の発症機構を誘導し、最
終的には、いくつかの脳領域に神経変性を起こすことになるが、これが、ＭＪＤの徴候及
び症状の根本原因となる。
【０００４】
ＭＪＤを矯正するための最も直接的で、特異的で、効果的なソリューションの１つは、
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて変異アタキシン－３発現を阻害することにより、障害の
一次的原因を標的とすることであろう。ＲＮＡｉは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）
の配列特異的なダウンレギュレーションを伴う自然発生の機構である。ｍＲＮＡのダウン
レギュレーションにより、発現するタンパク質の量が減少する。ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮ
Ａ（ｄｓＲＮＡ）によって誘導される。ｄｓＲＮＡの鎖のうちの１つは、標的であるｍＲ
ＮＡに対して実質的に又は完全に相補的である。この鎖は、ガイド鎖又はアンチセンス鎖
と呼ばれる。ＲＮＡｉの機構は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へのガイ
ド鎖の取り込みを伴う。このプロセスにおいて、ＲＩＳＣは、５’末端がその相補体とよ
り緩く対合する鎖を好む。ＲＩＳＣは、相補的な塩基対の形成によって標的ｍＲＮＡに結
合する、マルチプルターンオーバー複合体である。一旦標的ｍＲＮＡに結合したら、ＲＩ
ＳＣは、ｍＲＮＡを切断し、又は翻訳効率を低下させることができる。ＲＩＳＣは、ガイ
ド鎖のヌクレオチド１０及び１１に対合した残基間にあるｍＲＮＡを切断することができ
る。ＲＮＡｉは、発見されてから、特定の標的遺伝子をノックダウンするために幅広く使
用されてきた。ＲＮＡｉを誘導するために利用されてきたトリガーは、低分子干渉ＲＮＡ
（ｓｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の使用を伴う。さらに、ＲＮＡ
ｉを自然に誘導することができる分子、いわゆるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、天然
に存在する対応物を模倣する人工ｍｉＲＮＡを作製するために使用されてきた。これらの
戦略は、選定した遺伝子を標的化するように設計されたｄｓＲＮＡ分子を用意するという
共通点を有する。ＲＮＡｉの配列特異的な様式を利用するＲＮＡｉをベースとする治療法
が開発中であり、現在、いくつかは臨床試験中である。
【０００５】
ＲＮＡ干渉は、変異アタキシン－３遺伝子と非変異アタキシン－３遺伝子との両方の標
的化に利用されてきた（ＷＯ２００５１０５９９５、Ａｌｖｅｓら、２０１０）。後者の
場合、ラットにおける正常なアタキシン－３タンパク質のノックダウンには、いかなる明
らかな有害な効果もないことが示された。しかしながら、ヒトの脳の神経細胞が変異アタ
キシン－３遺伝子と非変異アタキシン－３遺伝子との両方の長期のサイレンシングに耐え
られるかどうかは、判明していない。したがって、ＭＪＤには何十年にもわたる治療が必
要とされるため、サイレンシングを制御する又は変異アレルのみを阻害する努力が検討さ
れるべきである。
【０００６】
最も特異的で効果的なソリューションのうちの１つは、アタキシン－３遺伝子のコード
領域内に位置するＳＮＰ、特に、疾患アレルと連鎖不平衡の関係にあるＳＮＰベースヌク
レオチドを標的化することであろう。例えば、伸長ＣＡＧトラクトの３’末端に位置する
ＳＮＰ（Ｃ
９８７
ＧＧ／Ｇ
９８７
ＧＧ：ｒｓ１２８９５３５７）中のシトシン（Ｃ）は、
上記疾患と連鎖不平衡の関係にあるものとして記述されており、世界中のＭＪＤ患者の７
０％では異常なＣＡＧリピート伸長が伴う。
【０００７】
変異アタキシン－３遺伝子のアレル特異的な抑制は、ｒｓ１２８９５３５７のシトシン
（Ｃ）を対象とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを使用して、細胞（ＵＳ１００７２２６４
Ｂ２）及びＭＪＤのげっ歯類モデル（Ａｌｖｅｓら、２００８ａ、Ｎｏｂｒｅｇａら、２
０１３）で調査されてきた。しかしながら、これらの従前の研究においては、設計された
配列は、変異アレルの完全なアレル特異的サイレンシングを行うことができなかった。さ
らに、げっ歯類モデルの中枢神経系（ＣＮＳ）におけるサイレンシング配列の毒性は、持
続的な処置又は野生型動物においては、評価されなかった。実際、ｓｈＲＮＡは、長期の
処置の場合、又は高用量が使用された場合においては、強い脳毒性につながり得ると最近
では報告されている。有毒な副作用は、細胞のＲＮＡｉ機構の飽和及び内因性ｍｉＲＮＡ
発現の変化と関連付けられている。さらに、従前のげっ歯類モデルにおける変異アタキシ
ン－３のアレル特異的ウイルスベースサイレンシングは、開頭術及び脳実質内へのウイル
スベクターの直接投与を要していたが、このウイルスベクターの直接投与は、侵襲性の手
順であり、潜在的な有害作用と関連付けられおり、脳の隅々までベクターが分散されるの
を制限するが、これにより、ＭＪＤの発症領域がすべて標的化されるわけではなくなって
しまう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
ＷＯ２００５１０５９９５
【非特許文献】
【０００９】
Ａｌｖｅｓら、２０１０
Ａｌｖｅｓら、２００８ａ
Ｎｏｂｒｅｇａら、２０１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記の事実は、本開示によって対処する技術的課題を説明するために開示されている。
【課題を解決するための手段】
（【００１１】以降は省略されています）

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