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公開番号2024160413
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-11-13
出願番号2024147493,2020559324
出願日2024-08-29,2019-12-12
発明の名称ゲノム編集された細胞の製造方法
出願人国立大学法人九州大学
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/09 20060101AFI20241106BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】ゲノム編集された細胞の製造方法等の提供。
【解決手段】(A)(a1)スペーサー配列の5’末端に1個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドRNA、(a2)標的配列に対して1塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドRNA、及び(a3)前記(a1)若しくは前記(a2)のガイドRNAを発現し得る発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種と、(B)Casタンパク質及び前記Casタンパク質を発現し得る発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種と、を細胞に導入する工程を含む、片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
（Ａ）（ａ１）スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡ、（ａ２）標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ、及び（ａ３）前記（ａ１）若しくは前記（ａ２）のガイドＲＮＡの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種と、
（Ｂ）Ｃａｓタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種と、
を細胞に導入する工程を含む、片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
続きを表示（約 760 文字）【請求項２】
前記（Ａ）が、スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加され、且つ前記スペーサー配列が、標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列である、ガイドＲＮＡ又はそれをコードする発現ベクターである、請求項１に記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
【請求項３】
前記スペーサー配列の５’末端に付加されたヌクレオチド残基が、全て同一のヌクレオチド残基である、請求項１又は２に記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
【請求項４】
前記スペーサー配列の５’末端に付加されたヌクレオチド残基が、シトシン残基又はグアニン残基である、請求項３に記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
【請求項５】
さらに、（Ｃ）ドナーベクターを細胞に導入する工程を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
【請求項６】
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、請求項１～５のいずれか一項に記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
【請求項７】
スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡ。
【請求項８】
前記スペーサー配列が、標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有する、請求項７に記載のガイドＲＮＡ。
【請求項９】
請求項７又は８に記載のガイドＲＮＡの発現ベクター。
【請求項１０】
さらに、Ｃａｓタンパク質を発現可能な、請求項９に記載の発現ベクター。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノム編集の分野に関する。本発明は、特に、片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法、当該製造方法に使用可能なガイドＲＮＡ、発現ベクター、及びキット、並びにゲノム編集パターンの予測方法、に関する。さらに、本発明は、ゲノム編集パターンの解析方法、及び当該解析方法に使用可能な細胞に関する。
本願は、２０１８年１２月１２日に、日本に出願された特願２０１８－２３２９４６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
続きを表示（約 4,900 文字）【背景技術】
【０００２】
クラスター化した規則的な配置の短い回文反復配列（ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔｓ：ＣＲＩＳＰＲ）は、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）遺伝子と共に、細菌及び古細菌において侵入外来核酸に対する獲得耐性を提供する適応免疫系を構成することが知られている。ＣＲＩＳＰＲは、ファージ又はプラスミドＤＮＡに起因することが多く、大きさの類似するスペーサーと呼ばれる独特の可変ＤＮＡ配列が間に入った、２４～４８ｂｐの短い保存された反復配列からなる。また、リピート及びスペーサー配列の近傍には、Ｃａｓタンパク質ファミリーをコードする遺伝子群が存在する。
【０００３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、外来性のＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質ファミリーによって３０ｂｐ程度の断片に切断され、ＣＲＩＳＰＲに挿入される。Ｃａｓタンパク質ファミリーの一つであるＣａｓ１及びＣａｓ２タンパク質は、外来性ＤＮＡのｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒａｄｊａｃｅｎｔｍｏｔｉｆ（ＰＡＭ）と呼ばれる塩基配列を認識して、その上流を切り取って、宿主のＣＲＩＳＰＲ配列に挿入し、これが細菌の免疫記憶となる。免疫記憶を含むＣＲＩＳＰＲ配列が転写されて生成したＲＮＡ（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡと呼ぶ。）は、一部相補的なＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）と対合し、Ｃａｓタンパク質ファミリーの一つであるＣａｓ９タンパク質に取り込まれる。Ｃａｓ９に取り込まれたｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡはＲＮＡａｓｅＩＩＩにより切断され、外来配列（ガイド配列）を含む小さなＲＮＡ断片（ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡｓ：ｃｒＲＮＡｓ）となり、Ｃａｓ９－ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が形成される。Ｃａｓ９－ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体はｃｒＲＮＡと相補的な外来侵入性ＤＮＡに結合し、ＤＮＡを切断する酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ）であるＣａｓ９タンパク質が、外来侵入性ＤＮＡを切断することよって、外から侵入したＤＮＡの機能を抑制及び排除する。
【０００４】
Ｃａｓ９タンパク質は外来侵入性ＤＮＡ中のＰＡＭ配列を認識して、その上流で二本鎖ＤＮＡを平滑末端になるように切断する。ＰＡＭ配列の長さや塩基配列は細菌種によってさまざまであり、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）では「ＮＧＧ」の３塩基を認識する。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）は２つのＣａｓ９を持っており、それぞれ「ＮＧＧＮＧ」又は「ＮＮＡＧＡＡ」の５～６塩基をＰＡＭ配列として認識する。(Ｎは任意の塩基を表す)。ＰＡＭ配列の上流の何ｂｐのところを切断するかも細菌種によって異なるが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓを含め大部分のＣａｓ９オルソログはＰＡＭ配列の３塩基上流を切断する。
【０００５】
近年、細菌でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを、ゲノム編集に応用する技術が盛んに開発されている。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを融合させて、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡキメラ（ｓｇＲＮＡ）として発現させ、活用している。これによりＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄｎｕｃｌｅａｓｅ：ＲＧＮ）を呼び込み、目的の部位でゲノムＤＮＡを切断する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムには、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型があるが、ゲノム編集で用いるのはもっぱらＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり、ＩＩ型ではＲＧＮとしてＣａｓ９タンパク質が用いられている。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質はＮＧＧという３つの塩基をＰＡＭ配列として認識するため、グアニンが２つ並んだ配列がありさえすればその上流を切断できる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いた方法は、標的ＤＮＡ配列と相同な配列を有する短いｓｇＲＮＡを合成するだけでよく、単一のタンパク質であるＣａｓ９タンパク質を用いてゲノム編集ができる。そのため、従来用いられていたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）やトランス活性化因子様作動体（ＴＡＬＥＮ）のようにＤＮＡ配列ごとに異なる大きなタンパク質を合成する必要がなく、簡便かつ迅速にゲノム編集を行うことができる。
例えば、特許文献１には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを活用したゲノム編集技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
国際公開第２０１４／０９３６６１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ゲノム編集により二本鎖切断されたＤＮＡは、相同組み換え修復（ＨｏｍｏｌｏｇｏｕｓＤｉｒｅｃｔｅｄＲｅｐａｉｒ：ＨＤＲ）又は非相同末端再結合（Ｎｏｎ－ＨｏｍｏｌｏｇｏｕｓＥｎｄ－ＪｏｉｎｉｎｇＲｅｐａｉｒ：ＮＨＥＪ）により修復されることが知られている。ＮＨＥＪの際には、修復の際に挿入及び／又は欠失（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ／ｄｅｌｅｔｉｏｎ：ｉｎｄｅｌ）が高頻度で誘導されるため、予期せぬ遺伝子変異が生じるおそれがある。
例えば、疾患遺伝子と正常遺伝子とをヘテロに有する場合、ゲノム編集により疾患遺伝子をノックアウトしようとすると、正常遺伝子にも高頻度で変異が誘導されるおそれがある。また、ＨＤＲにより正常遺伝子をノックインしようとしても、両アレルでノックインが生じる確率は極めて低い。そのため、ノックインが誘導されなかったアレルでは、ＮＨＥＪによりｉｎｄｅｌが導入されるおそれがある。
そのため、ゲノム編集により両方のアレルで二本鎖切断が生じた場合、片方のアレルに予期せぬ変異が誘導されるリスクがある。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法、並びに前記方法に使用可能なガイドＲＮＡ、発現ベクター、キットを提供することを目的とする。さらに、ゲノム編集パターンの予測方法、並びにゲノム編集パターンの解析方法、及び前記解析方法に使用可能な細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は以下の態様を含む。
［１］（Ａ）（ａ１）スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡ、（ａ２）標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ、及び（ａ３）前記（ａ１）若しくは前記（ａ２）のガイドＲＮＡの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種と、（Ｂ）Ｃａｓタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種と、を細胞に導入する工程を含む、片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
［２］前記（Ａ）が、スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加され、且つ前記スペーサー配列が、標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列である、ガイドＲＮＡ又はそれをコードする発現ベクターである、［１］に記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
［３］前記スペーサー配列の５’末端に付加されたヌクレオチド残基が、全て同一のヌクレオチド残基である、［１］又は［２］に記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
［４］前記スペーサー配列の５’末端に付加されたヌクレオチド残基が、シトシン残基又はグアニン残基である、［３］に記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
［５］さらに、（Ｃ）ドナーベクターを細胞に導入する工程を含む、［１］～［４］のいずれかに記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
［６］前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、［１］～［５］のいずれか一項に記載の片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法。
［７］スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡ。
［８］前記スペーサー配列が、標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有する、［７］に記載のガイドＲＮＡ。
［９］［７］又は［８］に記載のガイドＲＮＡの発現ベクター。
［１０］さらに、Ｃａｓタンパク質を発現可能な、［９］に記載の発現ベクター。
［１１］前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、［１０］に記載の発現ベクター。
［１２］（Ａ）（ａ１）スペーサー配列の５’末端に１個以上のヌクレオチド残基が付加されたガイドＲＮＡ、（ａ２）標的配列に対して１塩基又は複数塩基のミスマッチを有するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ、及び（ａ３）前記（ａ１）若しくは前記（ａ２）のガイドＲＮＡの発現ベクター、からなる群より選択される少なくとも１種を含む、片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造キット。
［１３］（Ｂ）Ｃａｓタンパク質及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１種をさらに含む、［１２］に記載の製造キット。
［１４］（ｉ）ガイドＲＮＡ若しくはその発現ベクター、及びＣａｓタンパク質若しくはその発現ベクターを細胞に導入してゲノム編集を行う工程、（ｉｉ）前記ゲノム編集を行った細胞からＤＮＡを抽出する工程、（ｉｉｉ）前記ＤＮＡから標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅する工程、（ｉｖ）前記増幅したＤＮＡ断片の配列解析を行い、前記標的領域へのｉｎｄｅｌ誘導率（Ｐ）を求める工程、及び（ｖ）下記式（ｍ）若しくは（ｍ１）及び（ｂ）若しくは（ｂ１）により、片側アレルのみへのｉｎｄｅｌ誘導率（ｍｏｎｏ）及び両側アレルへのｉｎｄｅｌ誘導率（ｂｉ）を求める工程、を含む、ゲノム編集パターンの予測方法。
ｍｏｎｏ＝２×Ｐ×（１－Ｐ）・・・（ｍ）
ｂｉ＝Ｐ
２
・・・（ｂ）
ｍｏｎｏ＝－１．３０３Ｐ
２
＋１．２７６１Ｐ＋０．０２７４・・・（ｍ１）
ｂｉ＝０．６５１５Ｐ
２
＋０．３６１９Ｐ－０．０１３７・・・（ｂ１）
［１５］一方のアレルに、局在化タンパク質コード配列と、切断部位と、第１の蛍光タンパク質コード配列と、がこの順にインフレームで連結されたキメラ遺伝子を含み、他方のアレルに、前記局在化タンパク質コード配列と、前記切断部位と、第２の蛍光タンパク質コード配列と、がこの順にインフレームで連結されたキメラ遺伝子を含む、細胞。
［１６］（Ｉ）［１５］に記載の細胞に、前記切断部位を標的とするガイドＲＮＡ若しくはその発現ベクター、及びＣａｓタンパク質若しくはその発現ベクターを導入してゲノム編集を行う工程、（ＩＩ）前記工程（Ｉ）の後、前記細胞の蛍光パターンを解析する工程、並びに（ＩＩＩ）前記工程（ＩＩ）で解析した蛍光パターンに基づいて、ゲノム編集パターンを判定する工程、を含む、ゲノム編集パターンの解析方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、片側アレルのみがゲノム編集された細胞の製造方法、並びに前記方法に使用可能なガイドＲＮＡ、発現ベクター、キットが提供される。さらに、ゲノム編集パターンの予測方法、並びにゲノム編集パターンの解析方法、及び前記解析方法に使用可能な細胞が提供される。
【図面の簡単な説明】
（【００１１】以降は省略されています）

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