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公開番号2024152535
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-10-25
出願番号2023075200
出願日2023-04-12
発明の名称微生物が産生する水素濃度の測定方法とキット
出願人MiZ株式会社
代理人
主分類G01N 33/497 20060101AFI20241018BHJP(測定;試験)
要約【課題】微生物がどの程度の水素を発生しているか測定する必要があるが、水素分子は水や空気よりも分子量が小さく、液体培地などの水中で発生した水素は容易に水中から大気中に抜けていくため、水中で発生した水素の累積量を測定することは難しい。
【解決手段】微生物が産生する水素の濃度の測定方法であって、耐圧機能を有する密閉可能な容器に前記微生物と液体培地を導入するステップと、前記微生物と前記液体培地を導入した前記密閉可能な容器を密封するステップと、前記密封した前記密閉可能な容器内の前記微生物を培養するステップと、前記微生物を培養するステップにおいて、前記微生物が発生した気体を前記液体培地内に溶解させるために前記密閉可能な容器を振盪させる、または、前記培養するステップが静置培養の場合は培養の後、前記密封可能な容器を開封する前に前記密封された前記密封可能な容器を振盪させるステップと、前記密封可能な容器を開封するステップと、前記密封可能な容器を開封するステップと、前記培養した後の液体培地内の水素濃度を測定するステップからなる方法である。
特許請求の範囲【請求項１】
微生物が産生する水素の濃度の測定方法であって、
耐圧機能を有する密閉可能な容器に前記微生物と液体培地を導入するステップと、
前記微生物と前記液体培地を導入した前記密閉可能な容器を密封するステップと、
前記密封した前記密閉可能な容器内の前記微生物を培養するステップと、
前記微生物を培養するステップにおいて、前記微生物が発生した気体を前記液体培地内に溶解させるために前記密閉可能な容器を振盪させる、または、前記培養するステップが静置培養の場合は培養の後、前記密封可能な容器を開封する前に前記密封された前記密封可能な容器を振盪させるステップと、
前記密封可能な容器を開封するステップと、
前記培養した後の液体培地内の水素濃度を測定するステップからなる方法。
続きを表示（約 430 文字）【請求項２】
前記密閉可能な容器を密閉する際に前記密閉可能な容器内に含まれる気泡の体積が、前記密閉可能な容器の体積の１％以下となるように密閉することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記密閉可能な容器を密閉する際に前記密閉可能な容器内に含まれる気泡の体積が、前記密閉可能な容器の体積の０．５％以下となるように密閉することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物を培養するステップにおいて、前記密閉した前記密封可能な容器内が、前記微生物が培養中に発生した気体によって加圧されることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１から４における微生物が産生する水素の濃度の測定方法に用いられるキットであって、
耐圧機能を有する密閉可能な容器と、
水素濃度測定装置または水素濃度測定試薬を有することを特徴とするキット。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体培地中で微生物が累積的に産生する水素の濃度を測定する方法および当該方法に用いる器具に関する。
続きを表示（約 3,600 文字）【背景技術】
【０００２】
近年、腸内細菌や発酵食品に用いられる微生物が水素を発生していることが明らかとなり、これらの微生物が発生している水素のヒトを含む哺乳類の健康に対する作用効果が注目されている（非特許文献１）。これらの微生物がどの程度の水素を発生しているか測定する必要があるが、水素分子は水や空気よりも分子量が小さく、液体培地などの水中で発生した水素は容易に水中から大気中に抜けていくため、水中で発生した水素の累積量を測定することは難しい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
ＩｃｈｉｋａｗａＹ，ＹａｍａｍｏｔｏＨ，ＨｉｒａｎｏＳＩ，ＳａｔｏＢ，ＴａｋｅｆｕｊｉＹ，ＳａｔｏｈＦ．Ｔｈｅｏｖｅｒｌｏｏｋｅｄｂｅｎｅｆｉｔｓｏｆｈｙｄｒｏｇｅｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ．ＭｅｄＧａｓＲｅｓ．２０２３；１３（３）：１０８－１１．
【０００４】
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、微生物の培養中に微生物が産生した水素の累積量を水素濃度として測定する方法と当該方法に用いる器具を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究の結果、微生物の培養中に微生物が産生する水素の累積量を測定することに成功した。
（１）微生物が産生する水素の濃度の測定方法であって、
耐圧機能を有する密閉可能な容器に前記微生物と液体培地を導入するステップと、
前記微生物と前記液体培地を導入した前記密閉可能な容器を密封するステップと、
前記密封した前記密閉可能な容器内の前記微生物を培養するステップと、
前記微生物を培養するステップにおいて、前記微生物が発生した気体を前記液体培地内に溶解させるために前記密閉可能な容器を振盪させる、または、前記培養するステップが静置培養の場合は培養の後、前記密封可能な容器を開封する前に前記密封された前記密封可能な容器を振盪させるステップと、
前記密封可能な容器を開封するステップと、
前記培養した後の液体培地内の水素濃度を測定するステップからなる方法。
（２）前記密閉可能な容器を密閉する際に前記密閉可能な容器内に含まれる気泡の体積が、前記密閉可能な容器の体積の１％以下となるように密閉することを特徴とする（１）に記載の方法である。
（３）前記密閉可能な容器を密閉する際に前記密閉可能な容器内に含まれる気泡の体積が、前記密閉可能な容器の体積の０．５％以下となるように密閉することを特徴とする（１）に記載の方法である。
（４）前記微生物を培養するステップにおいて、前記密閉した前記密封可能な容器内が、前記微生物が培養中に発生した気体によって加圧されることを特徴とする（１）から（３）のいずれか一つに記載の方法である。
（５）（１）から（４）における微生物が産生する水素の濃度の測定方法に用いられるキットであって、
耐圧機能を有する密閉可能な容器と、
水素濃度測定装置または水素濃度測定試薬を有することを特徴とするキットである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明をさらに説明する。
本発明において、「水素」とは分子状水素（すなわち、気体状水素）であり、特に断らない限り、単に「水素」又は「水素ガス」と称する。また、本明細書中で使用する用語「水素」は、分子式でＨ
２
、Ｄ
２
（重水素）、ＨＤ（重水素化水素）、又はそれらの混合ガスを指す。
【０００８】
本発明において、累積的な水素量をより正確に測定するために「密閉可能な容器」は耐圧性を有するものを使用することが好ましい。ここで耐圧性を有する密閉可能な容器としては、一般的に炭酸飲料の飲用に用いられるペットボトルやアルミニウム製のボトルを用いる事ができる。これらの密閉可能な容器は、微生物の培養中に微生物が産生する気体によって当該容器に内部が加圧されるように容器の変形が起こらないものを用いる事が好ましい。耐圧性を有する密閉可能な容器を用いることにより、微生物の培養により発生する水素や二酸化炭素等の気体によって容器内部が加圧されヘンリーの法則により、それらの気体が液体培地内に溶け込ませることができる。これらのボトルはボトルを密閉した時に、ボトル内部で発生した水素がボトルの内ぼから外部に壁面を通して漏れにくいため、微生物が容器内で発生した水素を含む気体を累積的に容器内に閉じ込めることができる。したがって、密封する際には、前記容器内から容器内で発生した気体が培養中に容器の外部に漏洩しないように密閉する必要がある。当該容器内において、一定時間の微生物の培養の後に、容器を開封し、液体培地内の水素濃度を所望の水素濃測定装置や水素濃度判定試薬を用いる事によって、微生物が累積的に産生した水素濃度を測定することができる。測定した水素濃度と用いた液体培地の量から、理想気体の状態方程式などの理論化学の方程式を用いる事によって、微生物が発生した水素の累積量（体積）を算出することができる。
【０００９】
培養中に微生物が発生した気体を液体培地に溶存させるために、培養に際しては、浸透培養器で密閉可能な容器を振盪培養してもよいし、また、静置して培養した後に密閉可能な容器を振盪することが好ましい。前記密閉可能な容器の振盪培養には一般的に生化学の実験で用いられている培養方法を適用することができ、そのような方法としては、旋回培養や回転培養が含まれる。また、静置培養を行った際には、培養後、前記密閉可能な容器を開封する前に前記密閉可能な容器を手動または振盪機や回転機を用いて培養中に微生物が発生した気体を液体培地に十分に溶存させるために混和させるステップを踏むことが好ましい。
【０００９】
本発明において、用いる事ができる微生物は、水素を産生する微生物であればなんでもよい。そのような、水素を産生する水素産生菌としては、バクテロイデス門の微生物、フィルミクテス門の微生物の他、大腸菌、食品の発酵に用いられる微生物であるが、微生物の種類に制限はない。このような微生物には、本願出願段階において水素を産生することが知られていない微生物であっても、本願出願の後に水素を発生することができることが解かる微生物についても適用することができる。
【００１０】
本発明において、用いる事ができる液体培地は、肉エキスや糖分、ミネラルなど培地成分の水溶液でありうる。このような液体培地には食品を水などの液体に溶かしたものが含まれ、鶏がらなどの肉類を加熱して抽出したものも含まれる。あた、本発明に用いる事ができる液体培地には、生化学や細胞生物学における実験で用いられる、酵母抽出粉末やトリプトンなどを用いる事ができる。液体培地に溶解することができる食品としては、例えば以下のような食品が含まれるが、これに権利範囲が限定されるということはない。米麹粉末（有限会社糀屋本店、大分県、日本）、ペースト状白味噌（山永味噌株式会社、埼玉、日本）、ペースト状赤味噌（山永味噌株式会社、埼玉、日本）、ペースト状あわせ味噌（山永味噌株式会社、埼玉、日本）、フリーズドライあわせ味噌「あさげ」（株式会社永谷園、東京、日本）、フリーズドライ赤味噌「ひるげ」（株式会社永谷園、東京、日本）、フリーズドライ白味噌「ゆうげ」（株式会社永谷園、東京、日本）、米粉２００メッシュ（粒径約６０μｍ）、３００メッシュ（粒径約５０μｍ）、４００メッシュ（粒径約４０μｍ）（みどりの里山居館製山形県酒田市）、ごはんと研ぎ汁に用いたお米として新潟県産こしひかり２０２２年産（アイリスフーズ株式会社製、宮城県仙台市）、鶏がらスープ（味の素食品株式会社製丸鶏がらスープ）、ガラクトオリゴ糖（ｈｅａｌｔｈｙ－ｃｏｍｐａｎｙ製）、還元麦芽糖（パリジェンヌ、伊藤忠製）、ぶどう糖（日本ガーリック株式会社、群馬、日本）、はちみつ（天長食品工業株式会社製（愛知県稲取市）純粋はちみつ）、アミラーゼ（第一三共ヘルスケア「新タカヂア錠」）、必須アミノ酸パウダー（ヘルシーカンパニー株式会社、広島県、日本）、コーンスターチ（川光物産株式会社、東京都、日本）、大豆たんぱく質（王子食品株式会社、京都府、日本）。
（【００１１】以降は省略されています）

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