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公開番号2024150746
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-10-23
出願番号2024127610,2019564903
出願日2024-08-02,2018-05-22
発明の名称純粋な駆虫組成物および関連する方法
出願人ユニバーシティーオブマサチューセッツ,University of Massachusetts
代理人個人,個人,個人
主分類A61K 38/17 20060101AFI20241016BHJP(医学または獣医学;衛生学)
要約【課題】対象において寄生虫または蠕虫感染を処置し、またはその発症の重篤度を低減するための組成物およびその製造方法、ならびに対象において寄生虫または蠕虫感染を処置するための方法を提供する。
【解決手段】処置するための方法は、単一種の殺線虫結晶タンパク質から形成される単離された天然の生物活性殺線虫結晶を含む組成物を、処置有効量で対象に投与することを含む。該単離された天然の生物活性殺線虫結晶は、細菌芽胞、または結晶形態の殺線虫結晶タンパク質以外の宿主細菌タンパク質を実質的に含まない。単離された天然の生物活性殺線虫結晶を製造する方法も開示する。該結晶タンパク質は、全長Cryタンパク質、トランケートされたCryタンパク質、Cryタンパク質バリアント、またはCryタンパク質サブバリアントでありうる。結晶タンパク質の例には、Cry5B、Cry21、Cry14A、Cry6AおよびCry13Aが含まれる。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
単一種の殺線虫結晶タンパク質から形成された、単離された天然の生物活性殺線虫結晶を含む医薬組成物において、該結晶タンパク質は芽胞不形成形態の宿主細菌によって産生され、該医薬組成物は、細胞芽胞、または結晶の形態の殺線虫結晶タンパク質以外の宿主細菌タンパク質を実質的に含まない、医薬組成物。
続きを表示（約 890 文字）【請求項２】
ヒト対象への経口投与のために適当な賦形剤をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
宿主細菌がBacillus種である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
宿主細菌がBacillus thuringiensis（Ｂｔ）である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
宿主細菌がE. coliまたはP. fluorescens種である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
芽胞不形成宿主細菌が、前記天然の生物活性殺線虫結晶が該細菌のサイトゾル中に捕らえられるように、芽胞形成の欠失もたらす遺伝子変異を持つよう遺伝子組換えされている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
芽胞形成の欠失をもたらす遺伝子変異が、下記のものからなる群から選択される１つまたはそれ以上の遺伝子の欠失または不活性化である、請求項６に記載の方法：kinA、kinB、spo0A、spo0B、spo0E、spo0F、spo0J、spo0M spoIIB、spoIID、spoIIE、spoIIF、spoIIG、spoIIL、spoIIM、spoIIIA、spoIIIB、spoIIIE、spoIVA、spoIVC、spoIVD、spoVG、spoVK、spoVL、spoVM、spoVN、spoVP、spoVQ、spoVID、σH、σF、σE、σG、およびσK。
【請求項８】
芽胞形成の欠失をもたらす遺伝子変異が、spo0A遺伝子の欠失または不活性化である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
宿主細菌が、前記単一種の殺線虫結晶タンパク質を芽胞不形成特異的プロモーターの制御下に発現するように遺伝子組換えされている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
芽胞不形成特異的プロモーターが、Ｃｒｙ３Ａ、ＧｅｒＡ、ＧＮＡＴ、またはＴａｄＡプロモーターである、請求項９に記載の医薬組成物。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
［連邦委託研究の明示］
本発明は、米国保健福祉省（ＨＨＳ）国立衛生研究所（ＮＩＨ）により与えられたグラント番号NIAID 5R01AI056189-13、および米国農務省（ＵＳＤＡ）国立食品農業研究所（ＮＩＦＡ）により与えられたグラント番号NIFA 2016-67015-24861の下、政府の助成を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
続きを表示（約 2,500 文字）【０００２】
［関連出願］
本願は、その内容が引用により本書の一部とされる２０１７年５月２３日出願の米国仮特許出願第６２／５１００８１号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトの消化管に寄生する土壌伝播蠕虫（ＳＴＨ）に、全世界で最も貧困な人々の２３億人、および最も貧困な子供４億人以上が感染している。土壌細菌Bacillus thuringiensis（Ｂｔ）により産生される結晶（Ｃｒｙ）タンパク質は、安全かつ効果的なＳＴＨ処置を提供する薬剤の候補である。しかしながら、Ｃｒｙタンパク質による駆虫の生物学的活性は確立されているものの、ＳＴＨ処置のためにヒトおよび動物の消化（ＧＩ）管に、無傷の生物活性Ｃｒｙタンパク質を効果的に届けることに関して、依然大きな課題が存在する。大勢の貧困患者を処置するのに、処置は非常に低い価格（１用量当たり１ドル未満）で大量に利用可能でなければならない開発途上国において、Ｃｒｙタンパク質を実用的ＳＴＨ処置剤として適用することは、Ｃｒｙタンパク質の発現および精製に係る費用およびスケールアップの問題のために制限されている。
【０００４】
Ｃｒｙタンパク質を提供する、安価で簡単でスケールアップ可能な方法は、該タンパク質をB. thuringiensisにおいて発現させることである。該細菌は、Ｃｒｙタンパク質を非常に高いレベルで発現するのに非常に適しており、環境への適用用にはすでに大規模で安価に培養されている。しかしながら、ＢｔにおけるＣｒｙタンパク質の高レベルでの産生には、芽胞形成が必要である。したがって、現在環境に適用されているＣｒｙタンパク質組成物は、細菌由来の結晶タンパク質と芽胞との両方を含む「芽胞－結晶溶解物」（ＳＣＬ）の形態のものである。このようなＳＣＬ組成物をヒトに適用するには、ヒトにおいて食中毒を引き起こす多くのエンテロトキシン遺伝子を含む可能性のある細菌芽胞の存在の故に、問題がある。さらに、芽胞は扱いが難しく有効性に劣るので、Ｂｔ芽胞を含む製剤はどれも単位重量当たり、必然的にかなりの量の不活性成分（芽胞）を活性成分（結晶）と共に含むことになるから、ヒトおよび動物のいずれに対しても投与がより困難である。芽胞と結晶タンパク質とを分離することは、両者がほぼ同じ大きさであるゆえに難しい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、タンパク質治療薬、例えば駆虫タンパク質を消化管に送達するための新たなアプローチが当分野において必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、芽胞形成を欠くかまたは芽胞形成能を持たない細菌を使用して、医薬としての使用に適した純度の高い殺線虫結晶製剤を製造できるという発見に基づく。本発明の純粋な殺線虫結晶の製剤は、芽胞結晶溶解物（ＳＣＬ）から精製された結晶タンパク質よりも優れた抗蠕虫作用を提供する。さらに、そのような製剤は、ヒトへの投与に適さない不純物の芽胞および宿主細菌タンパク質を実質的に含まない。いくつかの例示態様において、本発明の製剤は、可溶性の細胞成分、脂質、および細胞壁デブリを実質的に含まない。
【０００７】
一側面において、本開示は、単一種の殺線虫結晶タンパク質から形成される、単離された天然の生物活性殺線虫結晶を含む医薬組成物を提供する。殺線虫結晶タンパク質は芽胞不形成形態の宿主細菌によって産生され、医薬組成物は、細菌芽胞、または結晶形態の殺線虫結晶タンパク質以外の宿主細菌タンパク質を実質的に含まない。
【０００８】
いくつかの態様において、本発明の医薬組成物は、ヒト対象への経口投与のために適当な賦形剤を含む。いくつかの態様において、宿主細菌はBacillus種である。いくつかの態様において、宿主細菌はBacillus thuringiensis（Ｂｔ）である。いくつかの態様において、宿主細菌はEscherichia coliまたはPseudomonas fluorescens種である。
【０００９】
いくつかの態様において、芽胞不形成宿主細菌は、天然の生物活性殺線虫結晶が該細菌のサイトゾル中に捕らえられるように、芽胞形成の欠失もたらす遺伝子変異を持つよう遺伝子組換えされている。いくつかの態様において、芽胞形成の欠失をもたらす遺伝子変異は、以下のものからなる群から選択される１つまたはそれ以上の遺伝子の欠失または不活性化である：kinA、kinB、spo0A、spo0B、spo0E、spo0F、spo0J、spo0M spoIIB、spoIID、spoIIE、spoIIF、spoIIG、spoIIL、spoIIM、spoIIIA、spoIIIB、spoIIIE、spoIVA、spoIVC、spoIVD、spoVG、spoVK、spoVL、spoVM、spoVN、spoVP、spoVQ、spoVID、σH、σF、σE、σG、およびσK。一態様において、芽胞形成の欠失をもたらす遺伝子変異は、spo0A遺伝子の欠失または不活性化である。
【００１０】
いくつかの態様において、宿主細菌は、単一種の殺線虫結晶タンパク質を芽胞不形成特異的プロモーターの制御下に発現するように遺伝子組換えされている。いくつかの態様において、芽胞不形成特異的プロモーターは、Ｃｒｙ３Ａ、ＧｅｒＡ、ＧＮＡＴ、またはＴａｄＡプロモーターである。いくつかの態様において、単一種の殺線虫結晶タンパク質は、Ｃｒｙ５Ｂ、Ｃｒｙ５Ｃ、Ｃｒｙ５Ｄ、Ｃｒｙ６Ａ、Ｃｒｙ１３Ａ、Ｃｒｙ１４Ａ、Ｃｒｙ２１Ａ、Ｃｒｙ２１Ｂ、Ｃｒｙ５５Ｂ、ならびにそれらのバリアントおよびトランケーションからなる群から選択される。いくつかの態様において、殺線虫結晶タンパク質は、Ｃｒｙ５Ｂまたはそのバリアントもしくはフラグメントである。いくつかの態様において、殺線虫結晶タンパク質は、Ｃｒｙ５ＢバリアントＳｅｒ４０７Ｃｙｓである。
（【００１１】以降は省略されています）

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