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公開番号2024132786
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-10-01
出願番号2023119529
出願日2023-07-22
発明の名称水処理におけるアンモニア酸化機能遺伝子の検出方法
出願人中原大學
代理人個人
主分類G01N 33/543 20060101AFI20240920BHJP(測定;試験)
要約【課題】本発明は、以下の工程を含む、水処理におけるアンモニア酸化機能遺伝子の検出方法を提供する。
【解決手段】検出対象となるサンプルについて、アンモニア酸化機能遺伝子をPCRで増幅し、フォワードプライマー及びリバースプライマーの5’末端にそれぞれビオチン及びジゴキシゲニンを付加することにより、前記PCRに使用するプライマーを修飾する。次に、免疫化学に基づいて、抗体を生体認識に使用し、金ナノコロイド粒子を発色物質として使用する。サンプルはラテラルフロー免疫アッセイテストストリップのサンプルパッド上に配置され、サンプルはサンプルパッドから吸収パッドに流れる。サンプルがニトロセルロース膜を通って流れるときのテストラインとコントロールラインの両方の発色は、陽性結果を示す。コントロールラインのみの発色は陰性結果を示し、発色のない場合は試験無効を示す。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
検出対象となるサンプルについて、アンモニア酸化機能遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅し、フォワードプライマー及びリバースプライマーの５’末端にそれぞれビオチン及びジゴキシゲニンを付加することにより、前記ＰＣＲに使用するプライマーを修飾することと、
サンプルパッドと、
発色物質で構成され、前記発色物質は、金ナノコロイド粒子と一次抗体との複合体である結合パッドと、
サンプルの流動方向に応じて、テストラインとコントロールラインが順次描かれ、前記テストラインで使用される試薬はストレプトアビジンであり、前記コントロールラインは二次抗体で構成されるニトロセルロース膜と、
毛細管引力を提供し、残りのサンプルを収集するために使用される吸収性パッドと、
前記サンプルの前記流動方向に従って、前記サンプルパッド、前記結合パッド、前記ニトロセルロース膜、及び前記吸収パッドが順番に配置される下部カードと、を備えるラテラルフロー免疫アッセイテストストリップを提供することと、
前記ラテラルフロー免疫アッセイテストストリップの前記サンプルパッド上に前記サンプルを配置し、前記サンプルが前記サンプルパッドから前記吸収パッドに流れ、前記サンプルが前記ニトロセルロース膜を通って流れるときの前記テストラインと前記コントロールラインの両方の発色は陽性結果を示し、前記コントロールラインのみの発色は陰性結果を示し、発色のない場合は試験無効を示す、
水処理におけるアンモニア酸化機能遺伝子の検出方法。
続きを表示（約 860 文字）【請求項２】
前記一次抗体が、マウス抗ジゴキシゲニン抗体を含む、請求項１に記載の水処理におけるアンモニア酸化機能遺伝子の検出方法。
【請求項３】
前記二次抗体が、ヤギ抗マウス抗体を含む、請求項１に記載の水処理におけるアンモニア酸化機能遺伝子の検出方法。
【請求項４】
前記アンモニア酸化機能遺伝子が、アンモニア酸化微生物、亜硝酸酸化細菌、脱窒菌、またはアナモックス細菌の１６ＳｒＲＮＡを含む、請求項１記載の水処理におけるアンモニア酸化機能遺伝子の検出方法。
【請求項５】
前記サンプルの検出濃度が１ｎｇ～０．１ｆｇである、請求項１記載の水処理におけるアンモニア酸化機能遺伝子の検出方法。
【請求項６】
前記サンプルパッド上に前記サンプルを１ｎｇ～０．１ｆｇの量で配置する、請求項１記載の水処理におけるアンモニア酸化機能遺伝子の検出方法。
【請求項７】
前記サンプルパッドの材質が不織布を含み、前記結合パッドの材質が不織布を含み、
前記吸収パッドの材料が綿を含み、前記下部カードの材料がプラスチック及び粘着材料を含む、請求項１記載の水処理におけるアンモニア酸化機能遺伝子の検出方法。
【請求項８】
前記サンプルの流動方向において、前記サンプルパッドの長さが９ｍｍ～１９ｍｍであり、前記結合パッドの長さが６ｍｍ～１２ｍｍであり、前記ニトロセルロース膜の長さが１７ｍｍ～３３ｍｍであり、前記吸収パッドの長さが１４ｍｍ～２６ｍｍであり、前記下部カードの長さが４１ｍｍ～７７ｍｍである、請求項１記載の水処理におけるアンモニア酸化機能遺伝子の検出方法。
【請求項９】
前記サンプルパッド、前記結合パッド、前記ニトロセルロース膜、前記吸収パッド、及び前記下部カードの前記サンプルに垂直な流動方向の幅は同一であり、前記幅は２ｍｍ～６ｍｍである、請求項１記載の水処理におけるアンモニア酸化機能遺伝子の検出方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は検出方法に関し、特に水処理におけるアンモニア酸化機能遺伝子の迅速な検出方法に関する。
続きを表示（約 1,900 文字）【背景技術】
【０００２】
科学技術の発展に伴い、水質汚染は深刻化している。ハイテク産業から排出される廃水には、河川を深刻に汚染する高濃度のアンモニア態窒素が含まれている。したがって、下水処理が非常に重要である。現在、物理的、化学的、生物学的方法など、さまざまな効率的な下水処理技術が開発されている。物理的及び化学的下水処理システムは良い結果をもたらすことができるものの、大量の廃水による処理コストがその利点に見合っていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
近年、アナモックス法のバイオリアクターが徐々に注目を集めており、アンモニア態窒素廃水を低コストで効率よく処理できるシステムである。しかし、バイオリアクター内の微生物の分布と代謝を即座に分析できないため、操作者がリアクターを正確に制御できず、それによって操作するコストが増加する可能性があり、また、やみくもに修正すると、バイオリアクターがフリーズして、その効果が失われる可能性もある。これによって、実用化の普及が図れない可能性がある。アナモックスバイオリアクターの実用化には分子生物学的検出技術が非常に重要であり、現在そのような技術が多数存在する。例としては、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、マイクロアレイチップ、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）などが挙げられる。これらの方法は、バイオリアクター内の微生物を正確に分析できるものの、技術的なハードルが比較的高く、精密な設備が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記に基づいて、バイオリアクターの細菌相を分析するための生物学的検出方法が開発される。これにより、廃水処理施設の運転中のバイオリアクター内の細菌相の分析が高速化され、現場で即時に検出され、問題を知ることができ、これにより、操作するコストが削減され、現在の研究の重要なテーマとなっている。
【０００５】
本発明は、水処理におけるアンモニア酸化機能遺伝子の検出方法を提供する。ラテラルフロー免疫アッセイ法の迅速検出テストストリップを使用すると、肉眼で判断できる結果を１５分以内に得ることができ、これにより、高濃度窒素含有廃水の生物学的処理プロセスの細菌種に関するリアルタイムの情報を操作者に提供することができる。
【０００６】
本発明の水処理におけるアンモニア酸化機能遺伝子の検出方法は、以下の工程を含む。検出対象となるサンプルについて、アンモニア酸化機能遺伝子をＰＣＲで増幅し、フォワードプライマー及びリバースプライマーの５’末端にそれぞれビオチン及びジゴキシゲニンを付加することにより、前記ＰＣＲに使用するプライマーを修飾する。次に、サンプルパッド、結合パッド、ニトロセルロース膜、吸収パッド、及び下部カードを含むラテラルフロー免疫アッセイテストストリップが提供される。結合パッドは、発色物質で構成されており、発色物質は、金ナノコロイド粒子と一次抗体との複合体である。サンプルの流動方向に応じて、ニトロセルロースメンブレン上にテストラインとコントロールラインが順次描かれる。テストラインで使用される試薬はストレプトアビジンであり、コントロールラインは二次抗体で構成される。吸収パッドは毛細管引力を提供し、残りのサンプルを収集するために使用される。サンプルの流動方向に従って、サンプルパッド、結合パッド、ニトロセルロース膜、及び吸収パッドが、下部カード上に順番に配置される。次に、サンプルがラテラルフロー免疫アッセイテストストリップのサンプルパッド上に配置され、サンプルがサンプルパッドから吸収パッドに流れる。サンプルがニトロセルロース膜を通って流れるときのテストラインとコントロールラインの両方の発色は、陽性結果を示す。コントロールラインのみの発色は陰性結果を示し、発色のない場合は試験無効を示す。
【０００７】
本発明の一実施形態では、一次抗体はマウス抗ジゴキシゲニン抗体を含む。
【０００８】
本発明の一実施形態では、二次抗体はヤギ抗マウス抗体を含む。
【０００９】
本発明の一実施形態において、アンモニア酸化機能遺伝子は、アンモニア酸化微生物、亜硝酸酸化細菌、脱窒菌、またはアナモックス細菌の１６ＳｒＲＮＡを含む。
【００１０】
本発明の一実施形態では、サンプルの検出濃度は１ｎｇ～０．１ｆｇである。
（【００１１】以降は省略されています）

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