特許ウォッチ

公開番号2024087513
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-07-01
出願番号2022202366
出願日2022-12-19
発明の名称標的配列の検出方法及び検出キット
出願人学校法人名城大学
代理人弁理士法人快友国際特許事務所
主分類C12Q 1/6869 20180101AFI20240624BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】突然変異などの標的配列を的確にかつ迅速に検出する技術を提供する。
【解決手段】標的配列の検出方法は、標的配列を含むDNA一本鎖と、標的配列を含む一部分に特異的にハイブリダイズするプローブと、がハイブリダイズした部分DNA二本鎖の融解温度を取得する。この部分DNA二本鎖の融解温度は、標的配列特異的である。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
標的配列の検出方法であって、
前記標的配列を含むＤＮＡ一本鎖と、前記ＤＮＡ一本鎖の前記標的配列を含む一部分に特異的にハイブリダイズするプローブと、を準備する準備工程と、
前記ＤＮＡ一本鎖と、前記プローブとが特異的にハイブリダイズした部分ＤＮＡ二本鎖の融解温度を取得する融解工程と、
を備える、方法。
続きを表示（約 880 文字）【請求項２】
前記準備工程は、前記ＤＮＡ一本鎖を優勢的に増幅する核酸増幅反応により取得することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プローブは標識されていない、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記準備工程は、前記ＤＮＡ一本鎖を、３’末端が核酸増幅反応により伸長されない前記プローブの存在下で前記ＤＮＡ一本鎖を優勢的に増幅する核酸増幅反応により取得することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡ一本鎖は、塩基長が８０塩基以上２３０塩基以下である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記プローブの塩基長は、２０塩基以上７０塩基以下である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記標的配列は、２種以上の特徴をそれぞれ含む２種以上の標的配列を含み、
前記プローブは、前記２種以上の標的配列にそれぞれ特異的な２種以上のプローブを含む、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記標的配列は、微生物又はウイルスの薬剤感受性に関わる、２種以上の変異を含む２種以上の標的配列を含み、
前記プローブは、前記２種以上の標的配列に特異的な２種以上のプローブを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物は、Mycobacterium avium及びMycobacterium intracellulareであり、前記標的配列は、これらの微生物におけるクラリスロマイシン感受性に関する少なくとも１つの変異を含む少なくとも１つの標的配列である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記プローブは、前記クラリスロマイシン感受性に関する点突然変異を含んで３０塩基以上５０塩基以下であり、前記プライマーセットは、前記点突然変異を含んで８０塩基以上１５０塩基以下の塩基長の前記ＤＮＡ二本鎖を増幅可能に構成されている、請求項９に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本明細書は、標的配列を融解温度等により検出する方法及びそのためのキットに関する。
続きを表示（約 2,900 文字）【背景技術】
【０００２】
従来、一塩基多型（ＳＮＰｓ）などの変異を検出するには、例えば、変異を含む部分をＰＣＲにより選択的に増幅して、その増幅物に特異的にハイブリダイズする検出用のプローブを用いることが行われている。
【０００３】
例えば、近年、肺ＭＡＣ症の患者数が増大している。ＭＡＣ（Mycobacterium avium complex）は、Mycobacterium aviumとMycobacterium intracellulare との近縁な２菌種の総称である。肺ＭＡＣ症は、ＭＡＣを原因菌とする肺炎などの肺感染症である。肺ＭＡＣ症の治療の原則は、キードラッグであるマクロライド系抗菌薬のクラリスロマイシンを含む多剤併用療法である。
【０００４】
肺ＭＡＣ症治療における最も懸念すべき問題の一つとして、クラリスロマイシンに対する感受性が低下した耐性菌による治療効果の低下が挙げられる。肺ＭＡＣ症の治療においては、こうした菌の耐性化に応じて薬剤を適時に変更していく必要がある。そのため、肺ＭＡＣ症治療の開始時のみならず、定期的にクラリスロマイシンの感受性試験を実施する必要がある。現在、クラリスロマイシンの薬剤感受性試験は、ガイドラインに基づいた培養法が採用されている。
【０００５】
ＭＡＣのクラリスロマイシン耐性化は、23SリボソームRNA（23S rRNA）のドメインＶの点突然変異（2058～2059番目）によって誘導されることが知られている。クラリスロマイシン感受性である野生型ＭＡＣは、23S rRNAの2058～2059番目の塩基配列がAA型である一方で、６種類の突然変異（TA、GA、AG、CA、AC、AT）を有したクラリスロマイシン耐性のＭＡＣが存在することが報告されている（例えば、非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
Inagaki T, Yagi T, Ichikawa K, Nakagawa T, Moriyama M, Uchiya K, Nikai T, Ogawa K. 2011. Evaluation of a rapid detection method of clarithromycin resistance genes in Mycobacterium avium complex isolates. J Antimicrob Chemother 66:722-9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、こうした変異を検出するクラリスロマイシン感受性試験は、結果を得るまでに２週間以上の時間を要し、クラリスロマイシン耐性菌の出現に十分に適応できていない。このほか、種々の微生物やウイルスなどにおける突然変異やＳＮＰｓなどを、適時にかつ的確に検出したい要請があるが、現状、こうした要請に十分対応できてはいない。本明細書は、標的配列を的確かつ迅速に検出する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＰＣＲ増幅産物であるＤＮＡ二本鎖の温度上昇に伴う融解曲線の解析を利用することに着目した。さらに、ＤＮＡ二本鎖の融解曲線のみでは標的配列の相違を識別し難いことが多いことから、本発明者らは、標的配列の相違を、融解温度ないし融解曲線においてできるだけ大きな相違として検出する可能性を検討するに至った。
【０００９】
検討の結果、本発明者らは、標的配列を含むＤＮＡ一本鎖とこの標的配列を含む一部分に対して特異的にハイブリダイズするプローブとの部分ＤＮＡ二本鎖が、標的配列特異的であり、他の類似した配列と明確に区別できることを見出した。本明細書は、こうした知見に基づき以下の手段を提供する。
【００１０】
［１］標的配列の検出方法であって、
前記標的配列を含むＤＮＡ一本鎖と、前記ＤＮＡ一本鎖の前記標的配列を含む一部分に特異的にハイブリダイズするプローブと、を準備する準備工程と、
前記ＤＮＡ一本鎖と、前記プローブとがハイブリダイズした部分ＤＮＡ二本鎖の融解温度を取得する融解工程と、
を備える、方法。
［２］前記準備工程は、前記ＤＮＡ一本鎖を優勢的に増幅する核酸増幅反応により取得することを含む、［１］に記載の方法。
［３］前記プローブは標識されていない、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記準備工程は、前記ＤＮＡ一本鎖を、３’末端が核酸増幅反応により伸長されない前記プローブの存在下で前記ＤＮＡ一本鎖を優勢的に増幅する核酸増幅反応により取得することを含む、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記ＤＮＡ一本鎖は、塩基長が８０塩基以上２３０塩基以下である、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記プローブの塩基長は、２０塩基以上７０塩基以下である、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記標的配列は、２種以上の特徴をそれぞれ含む２種以上の標的配列を含み、
前記プローブは、前記２種以上の標的配列にそれぞれ特異的な２種以上のプローブを含む、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記標的配列は、微生物又はウイルスの薬剤感受性に関わる、２種以上の変異を含む２種以上の標的配列を含み、
前記プローブは、前記２種以上の標的配列に特異的な２種以上のプローブを含む、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記微生物は、Mycobacterium avium及びMycobacterium intracellulareであり、前記標的配列は、これらの微生物におけるクラリスロマイシン感受性に関する少なくとも１つの変異を含む少なくとも１つの標的配列である、［８］に記載の方法。
［１０］前記プローブは、前記クラリスロマイシン感受性に関する点突然変異を含んで３０塩基以上５０塩基以下であり、前記プライマーセットは、前記点突然変異を含んで８０塩基以上１５０塩基以下の塩基長の前記ＤＮＡ二本鎖を増幅可能に構成されている、［９］に記載の方法。
［１１］標的配列を融解によって検出するためのキットであって、
前記標的配列を含むＤＮＡ二本鎖を増幅するための一対のプライマーセットと、
前記ＤＮＡ二本鎖の一方のＤＮＡ一本鎖中の前記標的配列を含む一部分に特異的にハイブリダイズする、プローブと、
を備える、キット。
［１２］前記一対のプライマーセットは、前記ＤＮＡ二本鎖のうち前記一方のＤＮＡ一本鎖を優勢に増幅する非対照核酸増幅反応のためのセットである、［１１］に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
（【００１１】以降は省略されています）

関連特許