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公開番号2024058391
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-04-25
出願番号2022165722
出願日2022-10-14
発明の名称ゲノム編集方法およびゲノム編集用組成物
出願人株式会社インプランタイノベーションズ,国立研究開発法人産業技術総合研究所,TOPPANホールディングス株式会社
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/09 20060101AFI20240418BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】真核細胞ゲノム内の新たなPAM配列を認識して当該ゲノムを部位特異的に改変可能なゲノム編集手段を提供する。
【解決手段】真核細胞のゲノム内の標的DNA配列を部位特異的に改変する方法であって、前記真核細胞中に、
(1)塩基配列5’-NNACNN-3’(「N」は各々、アデニン、シトシン、チミン、およびグアニンから独立して選択される任意の1塩基)を含むPAM(プロトスペーサー隣接モチーフ)配列を認識するCasタンパク質、または、当該Casタンパク質をコードする核酸、および、
(2)ゲノム内の前記標的DNA配列にハイブリダイズし得ると共に、前記Casタンパク質と複合体を形成し、前記複合体の前記標的DNA配列への配列特異的結合を指向することが可能なガイドRNA、または、当該ガイドRNAをコードする核酸を導入することにより、前記真核細胞のゲノムを前記標的DNA配列において改変することを含む。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
真核細胞のゲノム内の標的ＤＮＡ配列を部位特異的に改変するための方法であって、
前記真核細胞中に、
（１）配列番号１に記載の塩基配列５’－ＮＮＡＣＮＮ－３’（ここで「Ｎ」は各々、アデニン、シトシン、チミン、およびグアニンから独立して選択される任意の１塩基を意味する。）を含むＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列を認識するＣａｓタンパク質、または、当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、および、
（２）ゲノム内の前記標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズし得ると共に、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記複合体の前記標的ＤＮＡ配列への配列特異的結合を指向することが可能なガイドＲＮＡ、または、当該ガイドＲＮＡをコードする核酸
を導入することにより、前記真核細胞のゲノムを前記標的ＤＮＡ配列において改変することを含む方法。
続きを表示（約 790 文字）【請求項２】
前記Ｃａｓタンパク質が、アビシコッカス（Abyssicoccus）属菌、好ましくはアビシコッカス・アルバス（Abyssicoccus albus）に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｃａｓタンパク質が、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項１または２に記載の方法
【請求項４】
前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号４に記載のアミノ酸配列と８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９２％以上、又は９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９８％以上、又は９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｃａｓタンパク質が、エンドヌクレアーゼ活性を有する、請求項１～４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＡＭ配列が、配列番号２に記載の塩基配列５’－ＮＮＡＣＧＮ－３’または配列番号３に記載の塩基配列５’－ＮＮＡＣＡＮ－３’を含む、請求項１～５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ガイドＲＮＡが、１本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であると共に、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１～６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ｃｒＲＮＡが、標的ＤＮＡ相補鎖と二本鎖を形成することが可能な１５～３０ヌクレオチド長のスペーサー配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ｃｒＲＮＡが、１２～３６ヌクレオチド長のステムループを含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記真核細胞が、動物細胞、植物細胞、又は微生物細胞である、請求項１～９の何れか一項に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学の分野に関し、さらに詳細にはゲノム編集の分野に関する。より具体的に、本発明は、真核細胞のゲノム内の標的ＤＮＡ配列を部位特異的に改変するための新たなゲノム編集方法および当該方法に用いられるゲノム編集用組成物等のゲノム編集手段に関する。
続きを表示（約 3,300 文字）【背景技術】
【０００２】
ゲノム編集技術として、部位特異的ＤＮＡ修飾タンパク質を利用することが知られている。中でも近年では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated proteins）システムをゲノム編集に応用する技術が盛んに開発され、利用されている。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムにはＩ型、II型、およびIII型があるが、ゲノム編集で最も多く用いられているのはII型である。II型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（RNA-guided nuclease：ＲＧＮ）ＲＧＮとして、Ｃａｓ９と呼ばれるヌクレアーゼを用いる。Ｃａｓ９は様々な真核細胞（例えば魚、植物、ヒト等）のゲノムを操作するのに使用されてきた（非特許文献１）。Ｃａｓ９は、一般的にはガイドＲＮＡとの複合体として用いられる。Ｃａｓ９とガイドＲＮＡとの複合体を細胞内に導入することにより、様々な動植物において標的遺伝子を変異させることができる。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と呼ばれる２つのＲＮＡと複合体を形成することにより、活性を有するエンドヌクレアーゼとして機能し、侵入したファージまたはプラスミド中の外来遺伝因子を切断する。このように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、標的ＤＮＡ配列と相同な配列を有する短いｓｇＲＮＡを合成するだけで利用可能である上に、特にII型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、単一のタンパク質であるＣａｓ９を用いてゲノム編集が可能であるという利点がある。
【０００３】
Ｃａｓ９は、ＤＮＡ中のＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ：protospacer adjacent motif）配列を認識し、その上流で二本鎖ＤＮＡを平滑末端になるように切断する。Ｃａｓ９が認識するＰＡＭ配列の長さや塩基配列は、Ｃａｓ９が由来する細菌種によってさまざまである。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のＣａｓ９（略称ＳｐｙＣａｓ９）は、５’－ＮＧＧ－３’という３つの塩基をＰＡＭ配列として認識するため、グアニンが２つ並んだ配列の上流を切断できる（特許文献１）（なお、別途明記しない限り、本明細書における塩基配列中の「Ｎ」は任意の塩基を表す。）。また、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）は２種類のＣａｓ９を有し、それぞれ５’－ＮＧＧＮＧ－３’又は５’－ＮＮＡＧＡＡ－３’という５～６塩基の配列をＰＡＭ配列として認識する（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
国際公開第２０１４／０９３６６１号
特表２０１５－５１０７７８号公報
【非特許文献】
【０００５】
Charpentier and Doudna, Nature, 2013, 495:50-51
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは優れたゲノム編集手段ではあるが、その汎用性を高めるために、認識可能なＰＡＭ配列の多様化が求められている。
【０００７】
本発明は上記課題に鑑みてなされたもので、その目的は、真核細胞ゲノム内の新たなＰＡＭ配列を認識して当該ゲノムを部位特異的に改変することが可能な、新たなゲノム編集手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前述の課題解決のために鋭意検討を行なった結果、５’－ＮＮＡＣＮＮ－３’を含む新たなＰＡＭ配列を認識するＣａｓタンパク質を見出し、斯かるＣａｓタンパク質をガイドＲＮＡと共に、標的ＤＮＡ配列をゲノム内に含む真核細胞内で発現させることで、新たな標的ＤＮＡ配列に基づく真核細胞ゲノムの部位特異的な改変が可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下を包含する。
［項１］真核細胞のゲノム内の標的ＤＮＡ配列を部位特異的に改変するための方法であって、
前記真核細胞中に、
（１）配列番号１に記載の塩基配列５’－ＮＮＡＣＮＮ－３’（ここで「Ｎ」は各々、アデニン、シトシン、チミン、およびグアニンから独立して選択される任意の１塩基を意味する。）を含むＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列を認識するＣａｓタンパク質、または、当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、および、
（２）ゲノム内の前記標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズし得ると共に、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記複合体の前記標的ＤＮＡ配列への配列特異的結合を指向することが可能なガイドＲＮＡ、または、当該ガイドＲＮＡをコードする核酸
を導入することにより、前記真核細胞のゲノムを前記標的ＤＮＡ配列において改変することを含む方法。
［項２］前記Ｃａｓタンパク質が、アビシコッカス（Abyssicoccus）属菌、好ましくはアビシコッカス・アルバス（Abyssicoccus albus）に由来する、項１に記載の方法。
［項３］前記Ｃａｓタンパク質が、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、項１または２に記載の方法
［項４］前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号４に記載のアミノ酸配列と８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９２％以上、又は９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９８％以上、又は９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、項１～３の何れか一項に記載の方法。
［項５］前記Ｃａｓタンパク質が、エンドヌクレアーゼ活性を有する、項１～４の何れか一項に記載の方法。
［項６］前記ＰＡＭ配列が、配列番号２に記載の塩基配列５’－ＮＮＡＣＧＮ－３’または配列番号３に記載の塩基配列５’－ＮＮＡＣＡＮ－３’を含む、項１～５の何れか一項に記載の方法。
［項７］前記ガイドＲＮＡが、１本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であると共に、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、項１～６の何れか一項に記載の方法。
［項８］前記ｃｒＲＮＡが、標的ＤＮＡ相補鎖と二本鎖を形成することが可能な１５～３０ヌクレオチド長のスペーサー配列を含む、項７に記載の方法。
［項９］前記ｃｒＲＮＡが、１２～３６ヌクレオチド長のステムループを含む、項７又は８に記載の方法。
［項１０］前記真核細胞が、動物細胞、植物細胞、又は微生物細胞である、項１～９の何れか一項に記載の方法。
［項１１］前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列が、動物細胞、植物細胞、又は微生物細胞における発現のためにコドン最適化されている、項１～１０の何れか一項に記載の方法。
［項１２］項１～１１の何れか一項に記載の方法に使用するためのゲノム編集用組成物であって、前記のＣａｓタンパク質、または、当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含む組成物。
［項１３］前記のガイドＲＮＡ、または、当該ガイドＲＮＡをコードする核酸を更に含む、項１２に記載の組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のゲノム編集方法によれば、５’－ＮＮＡＣＮＮ－３’を含む新たなＰＡＭ配列を認識するＣａｓタンパク質を用いることにより、新たな標的ＤＮＡ配列に基づく真核細胞ゲノムの部位特異的な改変が可能となる。
【図面の簡単な説明】
（【００１１】以降は省略されています）

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