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公開番号2024048272
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-04-08
出願番号2022154219
出願日2022-09-27
発明の名称細胞外小胞の製造方法及び細胞外小胞含有組成物
出願人セルソース株式会社
代理人個人
主分類C12N 1/02 20060101AFI20240401BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】培養中の細胞外小胞の確認に煩雑な手段を要さずに、充分量の細胞外小胞を確保できる適切なタイミングで細胞外小胞の分泌を終了でき、且つ、簡便な分離方法を適用できる細胞外小胞の製造方法を提供する。
【解決手段】本発明のある態様は、幹細胞を細胞外小胞分泌用培地に存在させて幹細胞から細胞外小胞を分泌させる分泌工程と、
前記細胞外小胞分泌用培地中の成分の物理的指標に基づいて前記分泌工程の終了の可否を判断する判断工程と、
を含む細胞外小胞の製造方法である。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
幹細胞を細胞外小胞分泌用培地に存在させて幹細胞から細胞外小胞を分泌させる分泌工程と、
前記細胞外小胞分泌用培地中の成分の物理的指標に基づいて前記分泌工程の終了の可否を判断する判断工程と、
を含む細胞外小胞の製造方法。
続きを表示（約 1,000 文字）【請求項２】
前記細胞外小胞分泌用培地が、使用前の状態において、粒子径が１～１０００ｎｍである微粒子の個数が、１×１０
９
個／ｍＬ未満の培地である、請求項１に記載の細胞外小胞の製造方法。
【請求項３】
前記細胞外小胞分泌用培地が、使用前の状態において、ＴＮＦ－α及びＴＲＡＩＬ／ＡＰＯ２Ｌを含む培地である、請求項１又は２に記載の細胞外小胞の製造方法。
【請求項４】
前記細胞外小胞分泌用培地が、使用前の状態において、総タンパク質量が１００μｇ／ｍＬ以下の培地である、請求項１又は２に記載の細胞外小胞の製造方法。
【請求項５】
前記分泌工程の前工程として、用意した培地が、使用前の状態において、粒子径が１～１０００ｎｍである微粒子の個数が、１×１０
９
個／ｍＬ未満であることを確認する確認工程をさらに含む、請求項１又は２に記載の細胞外小胞の製造方法。
【請求項６】
前記判断工程における前記分泌工程の終了可能条件が、
分泌工程開始時を基準として、培養上清１ｍＬにおける粒子径１～１０００ｎｍの微粒子の個数が３倍以上であることである、請求項１又は２に記載の細胞外小胞の製造方法。
【請求項７】
前記判断工程における前記分泌工程の終了可能条件が、
培養上清１ｍＬ中の粒子について、横軸に１ｎｍ刻みで粒子径を、縦軸に粒子数をそれぞれプロットしたとき、粒子径１～２００ｎｍの領域に、粒子数３×１０
７
個以上のピークが１つ以上存在することである、請求項１又は２に記載の細胞外小胞の製造方法。
【請求項８】
前記判断工程における前記分泌工程の終了可能条件が、
培養上清１ｍＬ中の粒子について、横軸に１ｎｍ刻みで粒子径を、縦軸に粒子数をそれぞれプロットしたとき、粒子径１～２００ｎｍの領域に、粒子数３×１０
７
個以上のピークが１つ以上存在することである、請求項６に記載の細胞外小胞の製造方法。
【請求項９】
前記幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項１又は２に記載の細胞外小胞の製造方法。
【請求項１０】
前記分泌工程の前工程として、前記幹細胞を増殖させる培養工程をさらに含む、請求項１又は２に記載の細胞外小胞の製造方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞外小胞の製造方法及び細胞外小胞含有組成物に関する。
続きを表示（約 1,500 文字）【背景技術】
【０００２】
ヒトを含む多細胞生物は、種々の多様な細胞から構成されている。これらの細胞は、細胞間コミュニケーションをとることにより、互いに協働して生理機能を維持している。細胞間コミュニケーションの手段としては、細胞間接着のような物理的な手段や、ホルモン、サイトカイン、成長因子等を介したシグナル伝達による手段が知られている。
【０００３】
近年、この細胞間コミュニケーションにおいて、細胞外小胞が重要な役割を果たしていることが明らかにされてきた。細胞外小胞は、細胞由来の脂質二重膜で囲まれた核を持たない（複製できない）粒子であり、由来する細胞の種類や環境ごとに、種々のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等を内包している。生体内で分泌された細胞外小胞は、血液等を通じて他の細胞へと運ばれ、その内包物等が様々な細胞応答を引き起こす。このような細胞外小胞の特徴を鑑み、現在、疾患の診断や、ドラックデリバリーシステムに応用するための技術開発が盛んに行われている。特許文献１には、エクソソーム（細胞外小胞の１種）を用いて、対象細胞に外来物質を導入する技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
国際公開公報２０１６／０７６３４７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、細胞外小胞は細胞の培養上清から得られるが、本発明者らは、従来公知の方法により得られた培養上清中には、細胞外小胞と同等の粒径を有する細胞外小胞様粒子が多く含まれていることを見出した。したがって、培養中に細胞外小胞の存在を確認するためには、細胞外小胞マーカーの検出等の煩雑な手段が必要である。また、これらの細胞外小胞様粒子のみを取り除くことは困難である。本発明は、上述の課題を鑑みてなされたものであり、培養中の細胞外小胞の確認に煩雑な手段を要さずに、充分量の細胞外小胞を確保できる適切なタイミングで細胞外小胞の分泌を終了でき、且つ、不純物が低減された細胞外小胞の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、この細胞外小胞様の粒子が培地由来の成分により構成されていることを見出した。そこで、本発明者らは、このような成分をできるだけ含まない培地を用い、さらに、物理的指標によって培養終了可否を判断することで、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明の第一の態様によれば、
幹細胞を細胞外小胞分泌用培地に存在させて幹細胞から細胞外小胞を分泌させる分泌工程と、
前記細胞外小胞分泌用培地中の成分の物理的指標に基づいて前記分泌工程の終了の可否を判断する判断工程と、
を含む細胞外小胞の製造方法が提供される。
【０００８】
前記第一の態様において、前記細胞外小胞分泌用培地は、使用前の状態において、粒子径が１～１０００ｎｍである微粒子の個数が、１×１０
９
個／ｍＬ未満の培地であってもよい。
【０００９】
前記第一の態様において、前記細胞外小胞分泌用培地は、使用前の状態において、ＴＮＦ－α及びＴＲＡＩＬ／ＡＰＯ２Ｌを含む培地であってもよい。
【００１０】
前記第一の態様において、前記細胞外小胞分泌用培地は、使用前の状態において、総タンパク質量が１００μｇ／ｍＬ以下の培地であってもよい。
（【００１１】以降は省略されています）

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