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公開番号2024044737
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-04-02
出願番号2022150461
出願日2022-09-21
発明の名称糸状菌変異株及びその利用
出願人花王株式会社,国立大学法人長岡技術科学大学
代理人弁理士法人アルガ特許事務所
主分類C12N 1/15 20060101AFI20240326BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】グルコースに起因する酵素生産阻害が抑制された糸状菌変異株の構築、及び当該糸状菌を用いた、多糖分解酵素の製造方法、バイオマスからの糖の製造方法及びバイオマスの糖化方法の提供。
【解決手段】以下の(a)～(c)より選ばれるタンパク質の発現が親株に比べて低下又は喪失した糸状菌変異株:
(a)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号2に示すアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質、
(c)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
以下の（ａ）～（ｃ）より選ばれるタンパク質の発現が親株に比べて低下又は喪失した糸状菌変異株：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つβ－グルコシダーゼ活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つβ－グルコシダーゼ活性を有するタンパク質。
続きを表示（約 1,200 文字）【請求項２】
前記タンパク質の発現が喪失している、請求項１記載の糸状菌変異株。
【請求項３】
前記タンパク質がＣｅｌ１ｂである、請求項１記載の糸状菌変異株。
【請求項４】
前記タンパク質をコードする遺伝子が欠失又は不活性化された請求項１～３のいずれか１項に記載の糸状菌変異株。
【請求項５】
前記タンパク質をコードする遺伝子が、以下の（ｄ）～（ｉ）のいずれかで示される請求項４記載の糸状菌変異株：
（ｄ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号１に示す塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つβ－グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つβ－グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｈ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つβ－グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｉ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つβ－グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
糸状菌がトリコデルマ属に属する、請求項１～５のいずれか１項に記載の糸状菌変異株。
【請求項７】
糸状菌がトリコデルマ・リーセイである、請求項１～５のいずれか１項に記載の糸状菌変異株。
【請求項８】
請求項１～７のいずれか１項に記載の糸状菌変異株をセルラーゼ誘導物質の存在下で培養し、培養物中にセルラーゼ及び／又はキシラナーゼを生成、蓄積させる工程、及び当該培養物からセルラーゼ及び／又はキシラナーゼを採取する工程を含むセルラーゼ及び／又はキシラナーゼの製造方法。
【請求項９】
請求項１～７のいずれか１項に記載の糸状菌変異株をセルラーゼ誘導物質及びグルコースの存在下で培養し、培養物中にセルラーゼ及び／又はキシラナーゼを生成、蓄積させる工程、及び当該培養物からセルラーゼ及び／又はキシラナーゼを採取する工程を含むセルラーゼ及び／又はキシラナーゼの製造方法。
【請求項１０】
培地中に、セルラーゼ誘導物質を総量で０．１～４０質量％含有し、グルコースを０．５～１５質量％含有する、請求項９記載のセルラーゼ及び／又はキシラナーゼの製造方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸状菌変異株、及び当該糸状菌を用いた多糖分解酵素の製造に関する。
続きを表示（約 2,700 文字）【背景技術】
【０００２】
バイオマスは、化石資源を除いた再生可能な生物由来の有機性資源である。その中でもセルロース系バイオマスが注目を浴びている。セルロースを分解することで糖を製造し、得られた糖から化学変換や微生物を用いた発酵技術により石油資源の代替物やバイオ燃料などの有用資源を製造する技術の開発が、世界中で行われている。
【０００３】
セルロース系バイオマスは、セルロース、ヘミセルロース、リグニンを主成分として構成される。このようなバイオマスは、セルロースを分解するセルラーゼ、ヘミセルロースを分解するヘミセルラーゼ、キシラナーゼなどが相乗的に作用することにより、複雑な形式で分解されることが知られている。セルロース系バイオマスの有効活用にあたっては、セルロースやヘミセルロースを高効率に分解可能な糖化酵素の開発が必要となる。
【０００４】
セルロースをグルコースにまで効率的に分解するには、上記の各種セルラーゼが総合的に機能することが必要であり、またキシランはセルロースについで植物に多く含まれる多糖類であるため、多種のセルラーゼ及びキシラナーゼを生産するトリコデルマ（Trichoderma）等の糸状菌は植物性多糖の分解菌として注目されてきた（非特許文献１）。
【０００５】
特に、トリコデルマは、セルラーゼ及びキシラナーゼを同時に生産することが可能であり、しかもその複合酵素を大量に生産することから、セルラーゼ生産の宿主として検討がされてきた（非特許文献２）。
しかしながら、これら糸状菌を用いて工業的にセルラーゼ及びキシラナーゼを生産するためには、安価大量生産のための技術開発、更なる高生産な菌株の作製が必要である。
【０００６】
一般的に微結晶性セルロースであるアビセルなどがセルラーゼ生産に用いられるが、高価であり工業用途への使用はコスト的に困難である。また、セルロース基質は不溶性のものが多く、工業プロセス上の負荷からも安価・可溶性の炭素源であるグルコースなどを用いることが望ましい。しかしながら、グルコースを用いた糸状菌の培養においては、カタボライト抑制と呼ばれる制御機構により、生産性の低下、または飽和が起こることが知られている。カタボライト抑制には、アスペルギルス（Aspergillus）属糸状菌などにおいては、広域制御型転写因子ＣｒｅＡや、ＣｒｅＢ、ＣｒｅＣ、ＣｒｅＤ等が関与していることが知られており（特許文献１、２）、これらの因子を制御することによりカタボライト抑制を調節できると考えられているが、いまだグルコース阻害の回避は不充分であると考えられている。また、トリコデルマ属糸状菌においても、カタボライト抑制に関して機構解析が進められている（特許文献３、非特許文献３）。特許文献４には、コレステロール合成酵素群遺伝子の転写遺伝子Ｓｒｅ１の発現が親株に比べて低下又は喪失した糸状菌変異株を用いたグルコースに起因する酵素生産阻害が抑制されたセルラーゼ及び／又はキシラナーゼの製造方法が開示されている。特許文献５及び非特許文献４には、チューブリンを機能低減又は機能喪失させた糸状菌変異株を用いたグルコースに起因する酵素生産阻害が抑制されたセルラーゼ及び／又はキシラナーゼの製造方法が開示されている。
【０００７】
一方、トリコデルマ・リーセイは、β－グルコシダーゼの１つであり、ＧＨ（Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｈｙｄｒｏｌａｓｅｆａｍｉｌｙ）１に属する酵素であるＣｅｌ１ｂを有する（非特許文献５）。Ｃｅｌ１ｂは、同じくＧＨ１に属するＣｅｌ１ａとともに、細胞内で、セルラーゼ誘導に必要な酵素として機能する。Ｃｅｌ１ａとＣｅｌ１ｂは、それぞれいずれかが欠損してもセルラーゼの誘導を遅延させるが、特にＣｅｌ１ａが欠損した場合に遅延がみられ、Ｃｅｌ１ａとＣｅｌ１ｂの同時欠損では、セルラーゼ誘導を大きく遅延させるもしくは誘導が行われないことが報告されている（非特許文献６、７）。しかし、グルコース高濃度存在下でのＣｅｌ１ｂとセルラーゼ生産の関係について詳細は明らかではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
特開２０１４－１６８４２４号公報
特開２０１５－３９３４９号公報
特表平１１－５１２９３０号公報
国際公開公報第２０１７／０１８４７１号
国際公開公報第２０１８／０２５９２９号
【非特許文献】
【０００９】
近藤昭彦、天野良彦、田丸浩、「バイオマス分解酵素研究の最前線-セルラーゼ・ヘミセルラーゼを中心として-」、シーエムシー出版、10頁～19頁
小笠原渉、志田洋介、「化学と生物」 vol.50、公益社団法人日本農芸化学会，50巻，8号，592頁～599頁，2012年08月
Amore A1, Giacobbe S, Faraco V. Curr Genomics. 2013 Jun;14(4):230-49
Shibata N, Kakeshita H, Igarashi K, Takimura Y, Shida Y, Ogasawara W, Koda T, Hasunuma T, Kondo A. Biotechnol Biofuels. 2021 Feb;14(1):39
Guo B, Sato N, Biely P, Amano Y, Nozaki K. Appl Microbiol Biotechnol. 2016 Jun;100(11):4959-68
Zhou Q, Xu J, Kou Y, Lv X, Zhang X, Zhao G, Zhang W, Chen G, Liu W. Eukaryot Cell. 2012 Nov;11(11):1371-81
Xu J, Zhao G, Kou Y, Zhang W, Zhou Q, Chen G, Liu W. Eukaryot Cell. 2014 Aug;13(8):1001-13
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、グルコースに起因する酵素生産阻害が抑制された糸状菌変異株の構築、及び当該糸状菌を用いた、多糖分解酵素の製造方法、バイオマスからの糖の製造方法及びバイオマスの糖化方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
（【００１１】以降は省略されています）

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