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公開番号2024041934
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-03-27
出願番号2024004564,2022074741
出願日2024-01-16,2015-01-23
発明の名称CAS9ターゲッティングをガイドする配列に関する方法および組成物
出願人ノースカロライナステートユニバーシティー,NORTH CAROLINA STATE UNIVERSITY
代理人個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/09 20060101AFI20240319BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】タンパク質のDNAターゲッティング及びゲノム編成のための方法及び組成物を提供する。
【解決手段】合成トランスコード化CRISPR(tracr)核酸(例えば、tracrRNA/DNA)構築物は、5’から3’の方向に、少なくとも3個のヌクレオチドを含む随意的な抗-ジッパー配列;少なくとも3個のヌクレオチドを含むバルジ配列;NNANNのヌクレオチド配列を含む抗-ステッチ配列;TNANNC、T(A/C)A(A/G)(G/A)C、などのヌクレオチド配列を含むネクサス配列;及び、少なくとも1つのヘアピンを有するヌクレオチド配列を含むヘアピン配列を含み、ヘアピン配列は少なくとも3個の一致する塩基対を含み、抗-ジッパー配列はバルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は抗-ステッチ配列のすぐ上流に位置し、抗-ステッチ配列はネクサス配列のすぐ上流に位置し、ネクサス配列はヘアピン配列のすぐ上流に位置する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
合成トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＤＮＡ）構築物であって、
５’から３’の方向に、
少なくとも約３個のヌクレオチドを含む随意的な抗－ジッパー配列；少なくとも約３個のヌクレオチドを含むバルジ配列；ＮＮＡＮＮのヌクレオチド配列を含む抗－ステッチ配列；ＴＮＡＮＮＣ、Ｔ（Ａ／Ｃ）Ａ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）Ｃ、ＴＣＡＡＡＣ、ＴＡＡＧＧＣ、ＧＡＴＡＡＧＧ、ＧＡＴＡＡＧＧＣＴＴ、ＴＣＡＡＧ、ＴＣＡＡＧＣＡＡ、Ｔ（Ｃ／Ａ）ＡＡ（Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）、ＧＡＴＡＡＧＧＣＣＡＴＧＣＣ、ＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣ、ＴＣＡＡＧＣＡＡＡＧＣ、またはＴＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣのヌクレオチド配列を含むネクサス配列；および、少なくとも１つのヘアピンを有するヌクレオチド配列を含むヘアピン配列を含み、
前記ヘアピンは、少なくとも３個の一致する塩基対を含み、
ここで、前記抗－ジッパー配列は、存在する場合は、前記バルジ配列のすぐ上流に位置し、前記バルジ配列は、前記抗－ステッチ配列のすぐ上流に位置し、前記抗－ステッチ配列は、前記ネクサス配列のすぐ上流に位置し、および、前記ネクサス配列は、前記ヘアピン配列のすぐ上流に位置する、
合成トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＤＮＡ）構築物。
続きを表示（約 2,900 文字）【請求項２】
合成ＣＲＩＳＰＲ核酸（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）構築物であって、
３’から５’の方向に、
少なくとも約３個のヌクレオチドを含む随意的なジッパー配列、少なくとも２個のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含むバルジ配列、ＮＮＴＮＮのヌクレオチド配列を含むステッチ配列、ヌクレオチドＧまたはＧＴＴを含むＧ
Ｒ１
、および、５’末端および３’末端を有するスペーサー配列であって、その３’末端に標的ＤＮＡと１００％の相補性を有する少なくとも７個のヌクレオチドを含むスペーサー配列、を含み、
前記ジッパー配列は、存在する場合は、前記バルジ配列のすぐ上流に位置し、前記バルジ配列は、前記ステッチ配列のすぐ上流に位置し、前記ステッチ配列は、前記Ｇ
Ｒ１
のすぐ上流に位置し、および、前記Ｇ
Ｒ１
は、前記スペーサー配列のすぐ上流に位置する、
合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物。
【請求項３】
合成ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイであって、
請求項２の２以上のＣＲＩＳＰＲ核酸構築物をコードするヌクレオチド配列を含み、
ここで、前記の２以上のＣＲＩＳＰＲ核酸構築物は、前記ヌクレオチド配列上で互いにすぐ隣に位置し、および、
前記の２以上のＣＲＩＳＰＲ核酸構築物の前記ステッチ配列は同一であり、および、
前記の２以上のＣＲＩＳＰＲ核酸構築物の前記スペーサー配列は、同一または非同一であり、および、
存在する場合は、前記の２以上のＣＲＩＳＰＲ核酸構築物の前記ジッパー配列は同一である、
ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイ。
【請求項４】
請求項１の合成ｔｒａｃｒ核酸構築物および請求項２の合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物を含む、キメラ核酸構築物であって、
前記合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物の前記ステッチ配列は、前記合成ｔｒａｃｒ核酸構築物の前記抗－ステッチ配列に１００％相補であってハイブリダイズし、
前記合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物の前記バルジ配列および前記合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物の前記バルジ配列は、非相補であり、
存在する場合は、前記合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物の前記ジッパー配列は、前記合成ｔｒａｃｒ核酸構築物の前記抗－ジッパー配列に少なくとも約７０％相補であってハイブリダイズする、
キメラ核酸構築物。
【請求項５】
請求項１の合成ｔｒａｃｒ核酸構築物、請求項２の合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物、請求項３のＣＲＩＳＰＲ核酸アレイ、または、請求項４のキメラ核酸構築物であって、
Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、
合成ｔｒａｃｒ核酸構築物、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物、ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイ、または、キメラ核酸構築物。
【請求項６】
請求項５の合成ｔｒａｃｒ核酸構築物、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物、ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイ、またはキメラ核酸構築物であって、
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＣＲＩＳＰＲ１（ＳｔｈＣＲ１）グループ由来のＣａｓ９である、
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＣＲＩＳＰＲ３（ＳｔｈＣＲ３）グループ由来のＣａｓ９である、
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｃｈｎｅｒｉＣＤ０３４（Ｌｂ）グループ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである、または、
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓＧＧ（Ｌｒｈ）グループ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである、
合成ｔｒａｃｒ核酸構築物、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物、ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイ、またはキメラ核酸構築物。
【請求項７】
請求項５の合成ｔｒａｃｒ核酸構築物、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物、ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイ、またはキメラ核酸構築物であって、
Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする前記アミノ酸配列は、配列番号１～配列番号５３のアミノ酸配列、または任意のそれらの組み合わせの群から選択される、
合成ｔｒａｃｒ核酸構築物、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物、ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイ、またはキメラ核酸構築物。
【請求項８】
請求項５の合成ｔｒａｃｒ核酸構築物、合成ＣＲＩＳＰ核酸構築物、ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイ、またはキメラ核酸構築物であって、
前記ネクサス配列は、ＧＡＴＡＡＧＧＣまたはＧＡＴＡＡＧＧＣＣＡＴＧＣＣであり、前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＣＲＩＳＰＲ１（ＳＴｈＣＲ１）グループ由来である；
前記ネクサス配列は、ＴＡＡＧＧＣまたはＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣであり、前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＣＲＩＳＰＲ３（ＳｔｈＣＲ３）グループ由来である；
前記ネクサス配列は、ＴＣＡＡＧＣまたはＴＣＡＡＧＣＡＡＡＧＣであり、前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｃｈｎｅｒｉＣＤ０３４（Ｌｂ）グループ由来である；または、
前記ネクサス配列はＴＣＡＡＡＣまたはＴＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣであり、前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓＧＧ（Ｌｒｈ）グループ由来である、
合成ｔｒａｃｒ核酸構築物、合成ＣＲＩＳＰ核酸構築物、ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイ、またはキメラ核酸構築物。
【請求項９】
請求項６から８のいずれか一項の合成ｔｒａｃｒ核酸構築物、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物、ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイ、またはキメラ核酸構築物であって、
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ活性部位モチーフ内に変異を含む、
合成ｔｒａｃｒ核酸構築物、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物、ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイ、またはキメラ核酸構築物。
【請求項１０】
請求項６から８のいずれか一項の合成ｔｒａｃｒ核酸構築物、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物、ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイ、またはキメラ核酸構築物であって、
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＨＮＨ活性部位モチーフ内に変異を含む、
合成ｔｒａｃｒ核酸構築物、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物、ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイ、またはキメラ核酸構築物。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
［優先権の陳述］
本出願は、２０１４年１月２４日に出願された米国仮出願第６１／９３１，５１５号の、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）の下での利益を主張し、その内容全体は、参照により本明細書中に援用される。
［本発明の分野］
本発明は、合成ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓシステムおよびゲノム編成のためのその使用方法に関する。
続きを表示（約 5,600 文字）【背景技術】
【０００２】
ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）は、関連配列（ｃａｓ）と組み合わせて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成し、多くの細菌において適応免疫を与える。ＣＲＩＳＰＲが仲介する免疫付与は、プラスミドおよびファージなどの侵襲性遺伝因子由来のＤＮＡの、新規の「スペーサー」としての取り込みを介して生じる。
【０００３】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、超可変配列により隔てられた短いＤＮＡリピートのアレイからなり、ｃａｓ遺伝子が隣接し、配列特異的ターゲッティングおよび干渉を介して、ファージおよびプラスミドなどの侵襲性遺伝因子に対する適応免疫を提供する（Ｂａｒｒａｎｇｏｕｅｔａｌ．２００７．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１５：１７０９－１７１２；Ｂｒｏｕｎｓｅｔａｌ．２００８．Ｓｃｉｅｎｃｅ３２１：９６０－４；ＨｏｒｖａｔｈａｎｄＢａｒｒａｎｇｏｕ．２０１０．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３２７：１６７－７０；ＭａｒｒａｆｆｉｎｉａｎｄＳｏｎｔｈｅｉｍｅｒ．２００８．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３２２：１８４３－１８４５；Ｂｈａｙａｅｔａｌ．２０１１．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．４５：２７３－２９７；ＴｅｒｎｓａｎｄＴｅｒｎｓ．２０１１．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４：３２１－３２７；Ｗｅｓｔｒａｅｔａｌ．２０１２．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．４６：３１１－３３９；ＢａｒｒａｎｇｏｕＲ．２０１３．ＲＮＡ．４：２６７－２７８）。典型的に、侵襲性ＤＮＡ配列は、新規の「スペーサー」として獲得され（Ｂａｒｒａｎｇｏｕｅｔａｌ．２００７．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１５：１７０９－１７１２）、それぞれがＣＲＩＳＰＲリピートと対になり、ＣＲＩＳＰＲ座において新規のリピート－スペーサーユニットとして挿入される。続いて、リピート－スペーサーアレイは、長いｐｒｅ－ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ）として転写され（Ｂｒｏｕｎｓｅｔａｌ．２００８．Ｓｃｉｅｎｃｅ３２１：９６０－４）、配列特異的認識を駆動する低分子干渉ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）へ処理される。具体的には、ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼにより仲介される配列特異的核酸切断のために、ヌクレアーゼを相補標的に向かってガイドする（Ｇａｒｎｅａｕｅｔａｌ．２０１０．Ｎａｔｕｒｅ．４６８：６７－７１；Ｈａｕｒｗｉｔｚｅｔａｌ．２０１０．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３２９：１３５５－１３５８；Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓｅｔａｌ．２０１１．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．３９：９２７５－９２８２；Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．２０１２．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３７：８１６－８２１；Ｇａｓｉｕｎａｓｅｔａｌ．２０１２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９：Ｅ２５７９－Ｅ２５８６；Ｍａｇａｄａｎｅｔａｌ．２０１２．ＰＬｏＳＯｎｅ．７：ｅ４０９１３；Ｋａｒｖｅｌｉｓｅｔａｌ．２０１３．ＲＮＡＢｉｏｌ．１０：８４１－８５１）。これらの広範なシステムは、細菌のほぼ半数（約４６％）および大多数の古細菌（約９０％）で生じる。それらは、ｃａｓ遺伝子含有量、ｃｒＲＮＡ生合成を駆動する生化学的プロセスにおける組織化および多様性、および、標的の認識および切断を仲介するＣａｓタンパク質複合体に基づいて、３つの主なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのタイプ（Ｍａｋａｒｏｖａｅｔａｌ．２０１１．ＮａｔｕｒｅＲｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：４６７－４７７；Ｍａｋａｒｏｖａｅｔａｌ．２０１３．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．４１：４３６０－４３７７）に分類される。Ｉ型およびＩＩ型では、特別なＣａｓエンドヌクレアーゼがｐｒｅ－ｃｒＲＮＡを処理し、それから、ｃｒＲＮＡに相補の核酸を認識および切断することのできる巨大な多重－Ｃａｓタンパク質複合体にアセンブルする。異なるプロセスは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに関する。ここで、ｐｒｅ－ＣＲＮＡは、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）がｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズするメカニズムにより処理される。ハイブリダイズしたｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡは、ＲＮａｓｅＩＩＩにより切断され、各スペーサーの５’末端を除去する第二のイベントが続き、ｔｒａｃｒＲＮＡとＣａｓ９の両方と結合したままの成熟ｃｒＲＮＡが生産される。成熟複合体は、それから、複合体内のスペーサー配列と相補の標的ｄｓＤＮＡ配列（「プロトスペーサー」配列）を探して両鎖を切断する。ＩＩ型システムでの複合体による標的の認識および切断は、ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体上のスペーサー配列と標的「プロトスペーサー」配列との間で相補の配列を必要とするだけでなく、プロトスペーサー配列の３’末端に位置するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列も必要とする。必要とされる正確なＰＡＭ配列は、異なるＩＩ型システム間で相違し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本開示は、合成ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの効率および特異性を高め、ゲノム編成および他の用途の効率および特異性を改善する、方法および組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一態様は、５’から３’の方向に、少なくとも約３個のヌクレオチドを含む随意的な抗－ジッパー配列；少なくとも約３個のヌクレオチドを含むバルジ配列；ＮＮＡＮＮのヌクレオチド配列を含む抗－ステッチ配列；Ｔ（Ａ／Ｃ）Ａ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）Ｃ（またはＵ（Ａ／Ｃ）Ａ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）Ｃ））、ＴＣＡＡＡＣ、（またはＵＣＡＡＡＣ）、ＴＡＡＧＧＣ（またはＵＡＡＧＧＣ）、ＧＡＴＡＡＧＧ（またはＧＡＵＡＡＧＧ）、ＧＡＴＡＡＧＧＣＴＴ（またはＧＡＵＡＡＧＧＣＵＵ）、ＴＣＡＡＧ（またはＵＣＡＡＧ）、ＴＣＡＡＧＣＡＡ（またはＵＣＡＡＧＣＡＡ）、Ｔ（Ｃ／Ａ）ＡＡ（Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）（またはＵ（Ｃ／Ａ）ＡＡ（Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｕ））、ＧＡＴＡＡＧＧＣＣＡＴＧＣＣ、ＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣ、ＴＣＡＡＧＣＡＡＡＧＣ、またはＴＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣのヌクレオチド配列を含むネクサス配列；および、少なくとも１つのヘアピンを有するヌクレオチド配列を含むヘアピン配列を含む、合成トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＤＮＡ）構築物を提供し、前記ヘアピンは、少なくとも３個の一致する塩基対を含み、
ここで、抗－ジッパー配列は、存在する場合は、バルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、抗－ステッチ配列のすぐ上流に位置し、抗－ステッチ配列は、ネクサス配列のすぐ上流に位置し、および、ネクサス配列は、ヘアピン配列のすぐ上流に位置する。
【０００６】
本発明の第２の態様は、３’から５’の方向に、少なくとも約３個のヌクレオチドを含む随意的なジッパー配列（存在する場合はｔｒａｃｒＲＮＡの抗－ジッパーにハイブリダイズする）、少なくとも２個のヌクレオチド（例えば、（－ＮＮ－）のヌクレオチド配列）を含むバルジ配列、ｔｒａｃｒＲＮＡの抗－ステッチにハイブリダイズするＮＮＴＮＮ（またはＮＮＵＮＮ）のヌクレオチド配列を含むステッチ配列、ヌクレオチドＧまたはＧＴＴを含むＧ
Ｒ１
、および、５’末端および３’末端を有するスペーサー配列であって、その３’末端に標的ＤＮＡと１００％の同一性を有する少なくとも７個のヌクレオチドを含むスペーサー配列を含む、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）構築物を提供し、ジッパー配列は、存在する場合は、バルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、ステッチ配列のすぐ上流に位置し、ステッチ配列は、Ｇ
Ｒ１
のすぐ上流に位置し、および、Ｇ
Ｒ１
は、スペーサー配列のすぐ上流に位置する。
【０００７】
本発明の第３の態様は、本発明の２以上のＣＲＩＳＰＲ核酸構築物をコードするヌクレオチド配列を含む合成ＣＲＩＳＰＲ核酸アレイを提供し、ここで、２以上のＣＲＩＳＰＲ核酸構築物は、前記ヌクレオチド配列上で互いにすぐ隣に位置し、前記２以上のＣＲＩＳＰＲ核酸構築物のジッパー配列は、存在する場合は同一であり、前記２以上のＣＲＩＳＰＲ核酸構築物のステッチ配列は同一であり、前記２以上のＣＲＩＳＰＲ核酸構築物のスペーサー配列は、同一または非同一である。
【０００８】
本発明の第４の態様は、本発明の合成ｔｒａｃｒ核酸構築物および本発明の合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物を含む、キメラ核酸構築物を提供し、ここで、存在する場合は、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物のジッパー配列は、前記合成ｔｒａｃｒ核酸構築物の抗－ジッパー配列と少なくとも約７０％相補でありハイブリダイズし、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物のステッチ配列は、前記合成ｔｒａｃｒ核酸構築物の抗－ステッチ配列と１００％相補でありハイブリダイズし、および、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物のバルジ配列および合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築物のバルジ配列は、非相補である。
【０００９】
本発明の第５の態様は、本開示のキメラ核酸構築物または前記キメラ核酸構築物を含む発現カセットを、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの存在下で標的ＤＮＡと接触させ、それにより、標的ＤＮＡに対するスペーサー配列のハイブリダイゼーションにより規定される領域内で、標的ＤＮＡの部位特異的切断を生じさせるステップを含む、二本鎖標的ＤＮＡの部位特異的切断のための方法を提供する。
【００１０】
本発明の第６の態様は、トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸分子およびＣＲＩＳＰＲ核酸分子を、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの存在下で標的ＤＮＡと接触させるステップを含む、二本鎖標的ＤＮＡの部位特異的切断のための方法を提供し、
ここで、（ａ）ｔｒａｃｒ核酸分子は、５’から３’の方向に、少なくとも約３個のヌクレオチドを含む随意的な抗－ジッパー配列；少なくとも約３個のヌクレオチドを含むバルジ配列；ＮＮＡＮＮのヌクレオチド配列を含む抗－ステッチ配列；ＴＮＡＮＮＣ、Ｔ（Ａ／Ｃ）Ａ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）Ｃ、ＴＣＡＡＡＣ、ＴＡＡＧＧＣ、ＧＡＴＡＡＧＧ、ＧＡＴＡＡＧＧＣＴＴ、ＴＣＡＡＧ、ＴＣＡＡＧＣＡＡ、Ｔ（Ｃ／Ａ）ＡＡ（Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）、ＧＡＴＡＡＧＧＣＣＡＴＧＣＣ、ＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣ、ＴＣＡＡＧＣＡＡＡＧＣ、またはＴＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣのヌクレオチド配列を含むネクサス配列；および、少なくとも２つのヘアピンを有するヌクレオチド配列を含むヘアピン配列を含む、ヌクレオチド配列によりコードされ、各ヘアピンは、少なくとも３個の一致する塩基対を含み、抗－ジッパー配列は、バルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、抗－ステッチ配列のすぐ上流に位置し、抗－ステッチ配列は、ネクサス配列のすぐ上流に位置し、および、ネクサス配列は、ヘアピン配列のすぐ上流に位置する；および
（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ核酸分子は、３’から５’の方向に、少なくとも約３個のヌクレオチドを含む随意的なジッパー配列、少なくとも２個のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列（例えば（－ＮＮ－）のヌクレオチド配列）を含むバルジ配列、ＮＮＴＮＮ（またはＮＮＵＮＮ）のヌクレオチド配列を含むステッチ配列、ヌクレオチドＧまたはＧＴＴを含むＧ
Ｒ１
、および、５’末端および３’末端を有するスペーサー配列であって、その３’末端に標的ＤＮＡと１００％の同一性を有する少なくとも７個のヌクレオチドを含むスペーサー配列を含む、ヌクレオチド配列によりコードされ、ジッパー配列は、バルジ配列のすぐ上流に位置し、バルジ配列は、ステッチ配列のすぐ上流に位置し、ステッチ配列は、Ｇ
Ｒ１
のすぐ上流に位置し、および、Ｇ
Ｒ１
は、スペーサー配列のすぐ上流に位置する、および、
さらにここで、抗－ジッパー配列およびジッパー配列が存在する場合は、それらは互いにハイブリダイズし、抗－ステッチ配列およびステッチ配列は互いにハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ核酸分子のスペーサー配列は、標的ＤＮＡの少なくとも一部（例えば、前記標的ＤＮＡの少なくとも約７個の連続したヌクレオチド（例えば、約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個など、および、その中の任意の範囲または変動）（標的ＤＮＡ上のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する）と、少なくとも約８０％相補でありハイブリダイズし、それにより、標的ＤＮＡに対するＣＲＩＳＰＲ核酸分子のスペーサー配列の相補結合により規定される領域内で、標的ＤＮＡの部位特異的切断を生じさせる。したがって、代表的な実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ核酸分子のスペーサー配列は、ＰＡＭに隣接する標的ＤＮＡ配列の一部にハイブリダイズし、標的配列は、標的ＤＮＡ配列の約７個～約２０個の連続したヌクレオチドを含む、から本質的になる、またはからなることができる。
（【００１１】以降は省略されています）

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