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公開番号2025178294
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-12-05
出願番号2025151644,2022567511
出願日2025-09-11,2021-06-09
発明の名称シークエンシングライブラリーの収率を増加させるための方法
出願人イルミナインコーポレイテッド,イルミナケンブリッジリミテッド,オレゴンヘルスアンドサイエンスユニバーシティー
代理人個人
主分類C12Q 1/6806 20180101AFI20251128BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】シークエンシングライブラリーの収率を増加させるための方法の提供。
【解決手段】本開示は、シークエンシングライブラリーを調製するための組成物及び方法に関する。一実施形態では、方法は、各末端に同じアダプターを有する標的核酸のライブラリーを生成し、次いで、1つのアダプターの同一性を切り替えて、異なるアダプターに隣接する標的核酸をもたらすことを含む。本開示の実施形態は、シークエンシングのために核酸を調製することに関する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
明細書に記載の発明。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年６月９日に出願された米国仮特許出願第６３／０３６，７１０号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 3,500 文字）【０００２】
（政府出資）
本発明は、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈにより授与されたＲ３５ＧＭ１２４７０４の下で政府の支援によってなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
（配列表）
本出願は、２０２１年６月８日に作成されたサイズ２キロバイトの「２０２１－０６－０８－ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題されたＡＳＣＩＩテキストファイルとして、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に電子的に提出された配列表を含む。配列表に含まれる情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
（発明の分野）
本開示の実施形態は、シークエンシングのために核酸を調製することに関する。特に、本明細書で提供される方法、組成物、システム、及びキットの実施形態は、核酸ライブラリーを対称ユニバーサル配列を含む断片から非対称ユニバーサル配列を含む断片に変換し、そこから配列データを取得することに関する。
【背景技術】
【０００５】
次世代シークエンシング（Next-generation sequencing、ＮＧＳ）技術により、ゲノム研究が革命的に変化する。有効であることが証明されたＮＧＳへの１つのアプローチは、断片が各末端に異なるアダプターを有するように処理されるシークエンシングライブラリーの生成である。次いで、ペアエンドシークエンシングを使用して、両方の鎖から配列情報を得る。ペアエンドアプローチの利点は、ランダムな様式で２つの独立した鋳型のそれぞれからの「ｎ」個の塩基をシークエンシングするよりも、単一の鋳型からの「ｎ」個の塩基をそれぞれ２本シークエンシングする方が、有意により多くの情報を得られる、ということである。しかしながら、各末端に異なるアダプターを付加するための方法は、第１のアダプターをＤＮＡ断片の一端及び第２のアダプターを同じＤＮＡ断片の他方の末端に選択的に標的化することが困難であるため、多くの場合非効率的である。例えば、シークエンシングライブラリーは、高度に効率的なタグメンテーションを使用して生成することができるが、実行可能なシークエンシングライブラリー分子は、順方向又は逆方向の一次配列の形態で異なるアダプターが分子の各末端に組み込まれている場合にのみ生成される。いくつかのタグメンテーション反応中に、２つの配列の各々が組み込まれる確率は等しく、したがって、半分の分子が順方向－順方向又は逆方向－逆方向アダプターの組み合わせを有するという結果になり、それによって理論収率が５０％に低減する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書に提示されるのは、核酸をシークエンシングライブラリーに効率的に変換する方法及び組成物である。本明細書に提示される方法は、核酸の上鎖、核酸の下鎖、又は核酸の上鎖及び下鎖の両方について、順方向及び逆方向の両方のアダプターでタグ付けされた標的核酸のライブラリーを生成するためにアダプター交換を使用する代替戦略を含む。本方法は、全ゲノムシークエンシング、ゲノム立体配座捕捉、循環ＤＮＡシークエンシング、標的シークエンシング、２つ以上の分析物のコアッセイ、例えば、ＲＮＡとＡＴＡＣ又はＤＮＡとＲＮＡ、及び単一細胞ゲノムを含むがこれらに限定されない、広範囲にわたるシークエンシングライブラリー調製方法に有用である。更に、このフォーマットにより、アダプター内に埋め込まれた１つ以上のインデックス配列の使用が可能になり、単一細胞コンビナトリアルインデックス付け（single-cell combinatorial indexing、ｓｃｉ）の適用が可能になる（例えば、Ｃｕｓａｎｏｖｉｃｈ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ
３４８，９１０－９１４（２０１５）、Ｖｉｔａｋｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１４，３０２－３０８（２０１７）、Ｍｕｌｑｕｅｅｎｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６，４２８－４３１（２０１８））。本明細書で提供される方法は、データ品質の改善、例えば、ｓｃｉ－ＨｉＣと比較した場合、ｓ３－ＡＴＡＣの場合は、シグナル濃縮を犠牲にすることなく細胞ごとに得られる通過読み取りに関して既知の方法に対する顕著な改善、ｓ３－ＷＧＳの場合はカバレッジ均一性、及びｓ３－ＧＣＣの場合は細胞ごとに得られるクロマチン接触の改善をもたらす。ｓ３－ＡＴＡＣ、ｓ３－ＷＧＳ、及びｓ３－ＧＣＣが本明細書に記載されている。
【０００７】
定義
本明細書で使用される用語は、別段の指定がない限り、関連技術の通常の意味をとるものと理解されるであろう。本明細書で使用されるいくつかの用語及びそれらの意味は、以下に記載される。
【０００８】
本明細書で使用される場合、用語「生物」及び「対象」とは、交換可能に使用され、微生物（例えば、原核生物又は真核生物）、動物、及び植物を指す。動物の例は、ヒトなどの哺乳類である。
【０００９】
本明細書で使用される場合、用語「標的核酸」とは、核酸に関して使用する場合、本明細書に記載の方法又は組成物の文脈における核酸の意味的識別子として意図され、別途明示的に示されるもの以外の核酸の構造又は機能を必ずしも限定するものではない。標的核酸は、本質的に既知又は未知の配列の任意の核酸であってもよい。例えば、ゲノムＤＮＡ断片（例えば、染色体ＤＮＡ）、プラスミドなどの染色体外ＤＮＡ、循環ＤＮＡ、又は循環ＲＮＡ、１つの細胞又は複数の細胞からの核酸、無細胞ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、又はｃＤＮＡであり得る。シークエンシングは、標的分子の全体又は一部の配列の決定をもたらし得る。標的は、核などの一次核酸試料に由来し得る。一実施形態では、標的は、各標的断片の末端にユニバーサル配列を配置することによって増幅に好適な鋳型に処理することができる。標的はまた、ｃＤＮＡへの逆転写によって一次ＲＮＡ試料から得ることもできる。一実施形態では、標的は、細胞内のＤＮＡ又はＲＮＡのサブセットに関して使用される。標的シークエンシングは、一般にはＰＣＲ増幅（例えば、領域特異的プライマー）又はハイブリダイゼーションベースの捕捉法又は抗体のいずれかによる、対象とする遺伝子の選択及び単離を使用する。標的濃縮は、方法の様々な段階で行うことができる。例えば、標的ＲＮＡ表現は、逆転写工程で標的特異的プライマーを使用するか、より複雑なライブラリーからサブセットをハイブリダイゼーションベースで濃縮することで得られる。例としては、エクソームシークエンシング又はＬ１０００アッセイがある（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎｅｔａｌ．，２０１７，Ｃｅｌｌ，１７１；１４３７－１４５２）。標的シークエンシングは、当業者に既知の濃縮プロセスのいずれかを含み得る。ユニバーサル配列の一端又は両端を有する標的核酸は、修飾標的核酸と称され得る。標的核酸など核酸への言及は、別途記載のない限り、一本鎖核酸及び二本鎖核酸の両方を含む。例えば、対称及び非対称の標的核酸は、本開示の方法において、二本鎖、一本鎖、又はある点で部分的に二本鎖及び一本鎖であり得る。
【００１０】
本明細書で使用する場合、用語「アダプター」及びその派生語、例えば、ユニバーサルアダプターとは、一般に、標的核酸に付加され得る任意の線状オリゴヌクレオチドを指す。アダプターは、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡであり得るか、又は二本鎖領域及び一本鎖領域の両方を含み得る。アダプターは、プライマー、例えばユニバーサルプライマーの少なくとも一部と実質的に同一であるか、又は実質的に相補的である配列；下流エラー補正、識別、又はシークエンシングを補助するためのインデックス（本明細書ではバーコード又はタグとも呼ばれる）、並びに／又はＵＭＩを含み得る。いくつかの実施形態では、アダプターは、試料中に存在する任意の標的配列の３’末端又は５’末端に実質的に非相補的である。いくつかの実施形態では、好適なアダプターの長さは、約６～１００ヌクレオチド、約１２～６０ヌクレオチド、又は約１５～５０ヌクレオチドの長さの範囲である。例えば、用語「アダプター（adaptor）」及び「アダプター（adapter）」は、交換可能に使用される。
（【００１１】以降は省略されています）

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