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公開番号2025176040
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-12-03
出願番号2025138128,2022517337
出願日2025-08-21,2020-09-18
発明の名称合成DNAベクターおよびその使用法
出願人アルデブロン,エル.エル.シー.
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/63 20060101AFI20251126BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】異種遺伝子を含む単離されたDNAベクターであって、インビボでの持続性を抑止し得る細菌プラスミドDNAおよび/または細菌シグネチャーを欠いている該DNAベクターを提供する。
【解決手段】治療用置換タンパク質をコードする1つまたは複数の異種遺伝子を含む、単離された環状DNAベクターであって、該DNAベクターが、
(a)複製開始点及び/又は薬物耐性遺伝子;ならびに
(b)組換え部位
を欠いている、前記単離された環状DNAベクターを提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
治療用置換タンパク質をコードする1つまたは複数の異種遺伝子を含む単離された環状DNAベクターであって、該DNAベクターが、
(a) 複製開始点および／または薬物耐性遺伝子；ならびに
(b) 組換え部位
を欠いている、前記単離された環状DNAベクター。
続きを表示（約 500 文字）【請求項２】
末端反復配列を含む、請求項1記載のDNAベクター。
【請求項３】
前記末端反復配列が、少なくとも10 bp長である、請求項2記載のDNAベクター。
【請求項４】
前記末端反復配列が、DDエレメントである、請求項3記載のDNAベクター。
【請求項５】
免疫原性細菌シグネチャーを欠いている、請求項1記載のDNAベクター。
【請求項６】
RNAポリメラーゼ停止部位を欠いている、請求項1記載のDNAベクター。
【請求項７】
CpGアイランドを実質的に欠いているプロモーターを含む、請求項1記載のDNAベクター。
【請求項８】
前記治療用置換タンパク質が、血液中に分泌される、請求項1記載のDNAベクター。
【請求項９】
前記1つまたは複数の異種遺伝子が、トランススプライシング分子またはその一部（例えば、結合ドメイン）を含む、請求項1記載のDNAベクター。
【請求項１０】
二本鎖である、請求項1記載のDNAベクター。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、全体として参照により本明細書に組み入れられる配列表を含む。2020年9月16日に作成された該ASCIIコピーは、51503-026WO2_Sequence_Listing_9.16.20_ST25 と命名され、18,453 バイトの大きさである。
続きを表示（約 3,700 文字）【０００２】
発明の分野
一般に、本発明は合成DNAベクターを特徴とする。
【背景技術】
【０００３】
背景
遺伝子治療は、対象における障害の根底にある遺伝的欠陥を修正するために異種遺伝子を標的細胞に形質導入することを伴う。過去数十年にわたり、遺伝子治療に使用するために種々の形質導入アプローチが開発されてきた。例えば、従来の細菌プラスミドDNAベクターは、遺伝子送達における汎用性の高いツールであるが、細菌由来のために限界を示し得る。プラスミドDNAベクターは、抗生物質耐性遺伝子および複製開始点などの細菌遺伝子を含む。さらに、プラスミドDNAベクターは、CpGモチーフなどの細菌シグネチャーを含む。加えて、プラスミドDNAベクターを生成するための細菌発現系の使用は、エンドトキシンまたは細菌ゲノムDNAおよびRNAなどの、細菌宿主からの混入不純物を導入するリスクを伴い、これは、例えば転写サイレンシングによって、インビボでの遺伝子発現の喪失につながる可能性がある。
【０００４】
組換えアデノ随伴ウイルス (rAAV) ベクターは、種々のモデル系において高効率遺伝子導入の実績が確立されており、現在、幅広いヒト疾患の治療様式として試験が行われている。rAAVベクターのゲノムは、インビボで（例えば、分裂後の細胞内で）環状エピソームとして持続し得る。感染後、一本鎖rAAV DNAは、細胞核内で二本鎖環状DNAに変換され、細胞の寿命の間エピソーム形態で持続する。このように、AAVベクター系の実質的な利点は、標的細胞内で長期間持続する能力である。一方、AAVベクターは、約4.5 Kbの限られたパッケージング容量、ウイルスタンパク質の免疫原性、および製造の難しさなどの付加的な欠点を伴い得る。
【０００５】
したがって、大きなペイロードを可能にし、かつ有害作用（例えば、炎症）のリスクを減らしながら、rAAVによって提供されるような遺伝子発現の長期持続性を高めるための汎用的でかつ効率的な方法が、当技術分野において必要である。
【発明の概要】
【０００６】
概要
本発明は、rAAVベクターのインビボ持続性を再現する、非ウイルス性環状DNAベクターを提供する。本DNAベクターは、非免疫原性であり、AAVパッケージング容量（約4.5 Kb）に制限されない。本発明はまた、（例えば、従来の細菌ベースの合成を上回る製造効率の向上を提供する無細胞方法を用いて）環状DNAベクターを生成する方法、環状DNAベクターを含む薬学的組成物、ならびに、例えば、異種遺伝子の持続的なエピソーム発現を誘導するため、および欠陥遺伝子に関連する疾患を処置するために、本明細書に記載されるベクターを使用する方法を特徴とする。
【０００７】
1つの局面において、本発明は、治療用置換タンパク質をコードする1つまたは複数の異種遺伝子を含む単離された環状DNAベクターであって、DNAベクターが、(a) 複製開始点（例えば、細菌の複製開始点）および／または薬物耐性遺伝子；ならびに(b) 組換え部位を欠いている、単離された環状DNAベクターを提供する。例えば、いくつかの態様において、DNAベクターは、複製開始点、薬物耐性遺伝子、および組換え部位を欠いている。治療用置換タンパク質は、例えば、酵素、増殖因子、ホルモン、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、抗アポトーシス因子、抗糖尿病因子、凝固因子、抗腫瘍因子、肝臓から分泌されるタンパク質、または神経保護因子であってもよい。いくつかの態様において、酵素は、エピジェネティックレギュレーターである。いくつかの態様において、エピジェネティックレギュレーターは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、ヒストンアセチラーゼ、DNAメチルトランスフェラーゼ、またはDNAデメチラーゼである。
【０００８】
別の局面において、本発明は、抗原結合タンパク質をコードする1つまたは複数の異種遺伝子を含む単離された環状DNAベクターを提供する。いくつかの態様において、DNAベクターは、(a) 複製開始点（例えば、細菌の複製開始点）および／または薬物耐性遺伝子；ならびに(b) 組換え部位を欠いている。例えば、いくつかの態様において、DNAベクターは、複製開始点、薬物耐性遺伝子、および組換え部位を欠いている。抗原結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であってもよい。抗原結合タンパク質は、サイトカイン、増殖因子、または細胞表面タンパク質（例えば、腫瘍関連抗原）に結合してもよい。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、TNF、LT、IFN-α、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、EMAP-II、GM-CSF、EGF、HER2、HER3、FGF、PDGF、BDNF、CNTF、CSF、G-CSF、NGF、PEDF、TGF、VEGF、ゴナドトロピン、インスリン様増殖因子、CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90、PD-1、PD-L1、アミロイドβ、アルカリホスファターゼ、アミロイドタンパク質A、CCR4、葉酸受容体、ムチン5AC、PCSK-9、ホスファチジルセリン、またはスクレロスチンに結合する。抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および／または抗原結合断片（例えば、Fab、scFv、scFabなど）であってもよい。
【０００９】
別の局面において、本発明は、酵素、増殖因子、ホルモン、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、抗アポトーシス因子、抗糖尿病因子、凝固因子、抗腫瘍因子、肝臓から分泌されるタンパク質、または神経保護因子をコードする1つまたは複数の異種遺伝子を含む単離された環状DNAベクターであって、DNAベクターが、(a) 複製開始点（例えば、細菌の複製開始点）および／または薬物耐性遺伝子；ならびに(b) 組換え部位を欠いている、単離された環状DNAベクターを提供する。増殖因子は、脳由来神経栄養因子（BDNF）、網様体神経栄養因子（CNTF）、コロニー刺激因子（CSF）、上皮増殖因子（EGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-SCF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、神経成長因子（NGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、色素上皮由来因子（PEDF）、トランスフォーミング増殖因子（TGF；例えば、TGF-β）、血管内皮増殖因子（VEGF）、ゴナドトロピン、またはインスリン様増殖因子であってもよい。インターロイキン（IL）は、IL-1（例えば、IL-1β）、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、またはIL-21であってもよい。インターフェロン（IFN）は、IFN-αまたはIFN-γであってもよい。凝固因子は、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XI因子、第XII因子、第XIII因子、またはフォン・ウィルブランド因子であってもよい。神経保護因子は、ニューロトロフィン（NT、例えば、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、またはCNTF）、Kifap3、Bcl-xl、Crmp1、Chk.beta.、CALM2、Caly、NPG11、NPT1、Eef1a1、Dhps、Cd151、Morf412、CTGF、LDH-A、Atl1、NPT2、Ehd3、Cox5b、Tuba1a、γ-アクチン、Rpsa、NPG3、NPG4、NPG5、NPG6、NPG7、NPG8、NPG9、およびNPG10からなる群より選択されてもよい。
【００１０】
別の局面において、本発明は、眼障害、肝障害、神経学的障害、免疫障害、がん、心血管障害、血液凝固障害、リソソーム貯蔵障害、または2型糖尿病からなる群より選択される障害に関連する1つまたは複数の異種遺伝子を含む単離された環状DNAベクターであって、DNAベクターが、(a) 複製開始点（例えば、細菌の複製開始点）および／または薬物耐性遺伝子；ならびに(b) 組換え部位を欠いている、単離された環状DNAベクターを提供する。例えば、いくつかの態様において、DNAベクターは、複製開始点、薬物耐性遺伝子、および組換え部位を欠いている。
（【００１１】以降は省略されています）

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