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公開番号2025170425
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-11-18
出願番号2025146613,2022025868
出願日2025-09-04,2022-02-22
発明の名称ネギ黒腐菌核病菌検出用オリゴヌクレオチド及びそれを用いた検出方法
出願人国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構,横浜植木株式会社
代理人弁理士法人特許事務所サイクス
主分類C12N 15/11 20060101AFI20251111BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】ネギ黒腐菌核病の発生初期を的確に把握するためのオリゴヌクレオチド、及びネギ黒腐菌核病菌A、B両群を検出する方法を提供する。
【解決手段】植物病原子嚢菌類の、グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(G3PDH)遺伝子領域、ヒートショックプロテイン60(HSP60)遺伝子領域、及びカルモジュリン(CaM)遺伝子領域からなる群より選択されるいずれか一つにおいて、Sclerotium cepivorumのA群株及びB群株の双方で保存され、かつBotrytis、Dumontini、Macrophomina、Sclerotinia、及びSclerotiumには多型が見られる領域、又はその相補領域に会合可能な、15-30塩基長のオリゴヌクレオチドを用いる。
【選択図】図7
特許請求の範囲【請求項１】
植物病原子嚢菌類の、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素(G3PDH)遺伝子領域、ヒートショックプロテイン60 (HSP60)遺伝子領域、及びカルモジュリン（CaM）遺伝子領域からなる群より選択されるいずれか一つにおいて、
Sclerotium cepivorumのA群株及びB群株の双方で保存され、かつ
Botrytis cinerea、Botrytis squamosa、Dumontinia tuberosa、Macrophomina phaseolina、Sclerotinia homoeocarpa、Sclerotinia kitajimana、Sclerotinia minor、Sclerotinia nivalis、Sclerotinia sclerotiorum、Sclerotinia trifoliorum、Sclerotium fumigatum、及びSclerotium rolfsiiには多型が見られる領域、又はその相補領域に会合可能な、15-30塩基長のオリゴヌクレオチド。
続きを表示（約 1,700 文字）【請求項２】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって：
配列番号25-30の配列では保存され、かつ
配列番号5-24の配列では多型が見られる領域、又はその相補領域に会合可能な、オリゴヌクレオチド；
配列番号51-56の配列では保存され、かつ
配列番号31-50の配列では多型が見られる領域、又はその相補領域に会合可能な、オリゴヌクレオチド；又は
配列番号77-82の配列では保存され、かつ
配列番号57-76の配列では多型が見られる領域、又はその相補領域に会合可能な、オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
植物病原子嚢菌類の、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素(G3PDH)遺伝子領域、ヒートショックプロテイン60 (HSP60)遺伝子領域、及びカルモジュリン（CaM）遺伝子領域からなる群より選択されるいずれか一つを増幅可能なプライマーセットであって、
Sclerotium cepivorumのA群株及びB群株の双方で保存され、かつ
Botrytis cinerea、Botrytis squamosa、Dumontinia tuberosa、Macrophomina phaseolina、Sclerotinia homoeocarpa、Sclerotinia kitajimana、Sclerotinia minor、Sclerotinia nivalis、Sclerotinia sclerotiorum、Sclerotinia trifoliorum、Sclerotium fumigatum、及びSclerotium rolfsiiには多型が見られる領域、又はその相補領域に会合可能な、各15-30塩基長のヌクレオチドである、プライマーセット。
【請求項４】
請求項３に記載のプライマーセットであって：
G3PDH遺伝子領域を増幅可能なものであり、配列番号25-30の配列では保存され、かつ
配列番号5-24の配列では多型が見られる領域、又はその相補領域に会合可能な、プライマーセット；
HSP60遺伝子領域を増幅可能なものであり、配列番号51-56の配列では保存され、かつ
配列番号31-50の配列では多型が見られる領域、又はその相補領域に会合可能な、プライマーセット；又は
CaM遺伝子領域を増幅可能なものであり、配列番号77-82の配列では保存され、かつ
配列番号57-76の配列では多型が見られる領域、又はその相補領域に会合可能な、プライマーセット。
【請求項５】
請求項３又は４に記載のプライマーセットであって：
G3PDH遺伝子領域を増幅可能なものであり、
一方のプライマーが、配列番号27の配列の位置79及び82を含む領域、又はその相補領域に会合可能であり、
他方のプライマーが、配列番号27の配列の位置329、335及び338を含む領域、又はその相補領域に会合可能である、プライマーセット。
【請求項６】
一方のプライマーが配列番号1の配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであり、他方のプライマーが、配列番号2の配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項３から５のいずれか１項に記載のプライマーセット。
【請求項７】
ネギ黒腐菌核病の診断のための、請求項３から６のいずれか１項に記載のプライマーセット。
【請求項８】
試料からDNAを抽出する工程；
抽出したDNAを鋳型として、請求項３から７のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程；
PCRによる増幅産物を検出する工程
を含み、増幅産物が検出された場合に試料中に病原菌が存在すると判断する、病原菌の検出方法。
【請求項９】
試料が、土壌、又は植物体若しくはその一部である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
PCRによる増幅産物を制限酵素で切断する工程をさらに含む、請求項８又は９に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、PCR法による農作物の病原菌の検出に関する。
続きを表示（約 5,700 文字）【背景技術】
【０００２】
ねぎは日本全国で栽培されている。主な産地は埼玉県、千葉県、茨城県、群馬県であり、白ねぎ（長ねぎ、根深ねぎ）を「秋冬ねぎ」や「春どりねぎ」の作型で栽培し、秋から春にかけて出荷するのが主流である。近年、ネギ黒腐菌核病の被害が拡大している。本病は土壌中に残存している病原菌の菌核から根に感染し、その後、盤茎部や葉鞘（白ねぎの可食部）に感染が広がり、隣接株にも平行感染する。早期に発病すると根腐れによる生育不良により坪枯れを生じ、また収穫期まで生育できても、土寄せ（白くやわらかい葉鞘部を確保するため、葉身の分岐部の下まで埋まるように土を寄せる。）された土壌中で葉鞘部や盤茎部を腐敗・褐変化させる。ネギ黒腐菌核病の防除対策としては、土壌消毒による土壌中の菌核の不活性化が有効だと考えられている。
【０００３】
本病の病原は糸状菌（ネギ黒腐菌核病菌、Sclerotium cepivorum）であり、低温（地温20℃以下）を好む。そのため、「秋冬ねぎ」の作型では土寄せを行う秋・冬季に土壌中で感染・発病が進展し、適期防除が非常に難しい。また収穫後に土壌中に残存した菌核が次作の感染源になることから、初発生から２～３年で圃場全体で被害が激発することとなる。
【０００４】
従来、ネギ黒腐菌核病の診断・同定は、まず目視診断として、圃場において生育不良・枯死株を引き抜き、根の状態や病徴（黒変化、菌核の有無）の観察を行う。その後、感染した植物体（主に葉鞘部）に形成された菌核の培養を２～４週間行い、培養性状（菌糸の生育速度、菌叢の色・形）や培地上での菌核形成の様子などから確定診断を行う。また、Haqらは、たまねぎの黒腐菌核病の原因菌であるSclerotium cepivorum由来の5.8S rRNA遺伝子とその近傍のITS領域の一部を増幅するためのPCRプライマーを設計し、感染の初期段階で、たまねぎに本菌が存在することを確認するための方法として提供した（非特許文献１）。WoodhallらはITS領域を標的として、大量の土壌から菌核を検出するためのリアルタイムPCR用のプライマーを開発し(非特許文献２)、この方法が土壌サンプル中のSclerotium cepivorumのレベルを定量するのに適していると述べた。また、伊代住らは国内の発生菌株（静岡県）を高感度で検出するためのネステッドPCR用のプライマーを開発した(非特許文献３)。またAmselemらは、ネギ黒腐菌核病菌の近縁子嚢菌であるエンダイブ菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）の1株及び灰色かび病菌（Botrytis cinerea）の2株についてゲノムを配列決定し、Glyceraldehyde-3-phosphate (G3PDH)とHeat shock protein 60 (HSP60)を含む5つの遺伝子座の系統樹を構築した（非特許文献４）。
【０００５】
Sclerotium cepivorumの菌核に関し、守川らは培地上の菌核形成には２つの型があることを報告した（非特許文献５）。また本発明者らは、形態的特徴からＡ、Ｂの２群に類別されるSclerotium cepivorumの菌株について、HSP60、G3PDH、Calmodulin の分子系統解析を行い、形態的特徴で類別したA群とB群は分子系統解析の結果と一致したことを報告した（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
Haq MA, Collin HA, Tomsett AB, Jones, MG (2003) Detection of Sclerotium cepivorum within onion plants using PCR primers. Physiological and Molecular Plant Pathology, 62(3), 185-189.
Woodhall JW, Webb KM, Giltrap PM, Adams IP, Peters JC, Budge GE, Boonham N (2012) A new large scale soil DNA extraction procedure and real-time PCR assay for the detection of Sclerotium cepivorum in soil. European Journal of Plant Pathology, 134(3), 467-473.
伊代住浩幸, 川部眞登 (2019) DNA リボソームDNA-ITS 領域のNested PCR によるネギ黒腐菌核病菌（Sclerotium cepivorum Berkeley）の検出. 関西病害虫研究会報, 61: 133-136
Amselem J et al (2011) Genomic Analysis of the Necrotrophic Fungal Pathogens Sclerotinia sclerotiorum and Botrytis cinerea. PLos Genetics, 7(8): e1002230.
Morikawa, T., Teranaka, S., Okuda, S., & Natsuaki, T. (1987). 培地上における Sclerotium cepivorum の菌核及び小型分生子の形成過程. 日本植物病理学会報, 53(1), 秋季関東部会講演要旨, 118
片岡善仁, 宮田伸一, キムオッキョン, 根岸寛光, 篠原弘亮 (2018) 日本国内におけるネギ黒腐菌核病菌の新たな菌糸和合群と分子系統解析. 日本植物病理学会報, 84(3), 平成30年度日本植物病理学会大会講演要旨, 257
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
土壌消毒によるネギ黒腐菌核病菌核の不活性化は、中・多発生した圃場では安定した効果を得ることが難しく、また全面被覆を要する土壌消毒処理は経費的・労力的に負担が大きい。こうしたことから本病の発生現場では、ねぎ生育期（定植時や土寄せ処理時）に効果的な薬剤を灌注・散布する生育期防除体系が確立されつつあり、被害を低減させることが可能となってきた。この防除体系をより効率的に活用するためには発生初期を的確に把握することが重要である。
【０００８】
また、これまでにネギ黒腐菌核病菌の検出のために設計されたPCR用のプライマーセットにより、各地で発生する菌株がすべて検出できるかどうかは明かではなかった。本発明者らの検討によると、既存のプライマーセット（前掲非特許文献１、２）は、ネギ黒腐菌核病菌Ｂ群は検出できるが、Ａ群に対しては偽陰性を示した。Ａ、Ｂ両群を検出できる方法が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下を提供する。
［１］植物病原子嚢菌類の、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素(G3PDH)遺伝子領域、ヒートショックプロテイン60 (HSP60)遺伝子領域、及びカルモジュリン（CaM）遺伝子領域からなる群より選択されるいずれか一つにおいて、
Sclerotium cepivorumのA群株及びB群株の双方で保存され、かつ
Botrytis cinerea、Botrytis squamosa、Dumontinia tuberosa、Macrophomina phaseolina、Sclerotinia homoeocarpa、Sclerotinia kitajimana、Sclerotinia minor、Sclerotinia nivalis、Sclerotinia sclerotiorum、Sclerotinia trifoliorum、Sclerotium fumigatum、及びSclerotium rolfsiiには多型が見られる領域に会合可能な、15-30塩基長のオリゴヌクレオチド。
［２］１に記載のオリゴヌクレオチドであって：
配列番号25-30の配列では保存され、かつ
配列番号5-24の配列では多型が見られる領域、又はその相補領域に会合可能な、オリゴヌクレオチド；
配列番号51-56の配列では保存され、かつ
配列番号31-50の配列では多型が見られる領域、又はその相補領域に会合可能な、オリゴヌクレオチド；又は
配列番号77-82の配列では保存され、かつ
配列番号57-76の配列では多型が見られる領域、又はその相補領域に会合可能な、オリゴヌクレオチド。
［３］植物病原子嚢菌類の、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素(G3PDH)遺伝子領域、ヒートショックプロテイン60 (HSP60)遺伝子領域、及びカルモジュリン（CaM）遺伝子領域からなる群より選択されるいずれか一つを増幅可能なプライマーセットであって、
Sclerotium cepivorumのA群株及びB群株の双方で保存され、かつ
Botrytis cinerea、Botrytis squamosa、Dumontinia tuberosa、Macrophomina phaseolina、Sclerotinia homoeocarpa、Sclerotinia kitajimana、Sclerotinia minor、Sclerotinia nivalis、Sclerotinia sclerotiorum、Sclerotinia trifoliorum、Sclerotium fumigatum、及びSclerotium rolfsiiには多型が見られる領域に会合可能な、各15-30塩基長のヌクレオチドである、プライマーセット。
［４］３に記載のプライマーセットであって：
G3PDH遺伝子領域を増幅可能なものであり、配列番号25-30の配列では保存され、かつ
配列番号5-24の配列では多型が見られる領域、又はその相補領域に会合可能な、プライマーセット；
HSP60遺伝子領域を増幅可能なものであり、配列番号51-56の配列では保存され、かつ
配列番号31-50の配列では多型が見られる領域、又はその相補領域に会合可能な、プライマーセット；又は
CaM遺伝子領域を増幅可能なものであり、配列番号77-82の配列では保存され、かつ
配列番号57-76の配列では多型が見られる領域、又はその相補領域に会合可能な、プライマーセット。
［５］３又は４に記載のプライマーセットであって：
G3PDH遺伝子領域を増幅可能なものであり、
一方のプライマーが、配列番号27の配列の位置79及び82を含む領域、又はその相補領域に会合可能であり、
他方のプライマーが、配列番号27の配列の位置329、335及び338を含む領域、又はその相補領域に会合可能である、プライマーセット。
［６］一方のプライマーが配列番号1の配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであり、他方のプライマーが、配列番号2の配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドである、３から５のいずれか１項に記載のプライマーセット。
［７］ネギ黒腐菌核病の診断のための、３から６のいずれか１項に記載のプライマーセット。
［８］試料からDNAを抽出する工程；
抽出したDNAを鋳型として、請求項３から７のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程；
PCRによる増幅産物を検出する工程
を含み、増幅産物が検出された場合に試料中に病原菌が存在すると判断する、病原菌の検出方法。
［９］試料が、土壌、又は植物体若しくはその一部である、８に記載の方法。
［１０］ PCRによる増幅産物を制限酵素で切断する工程をさらに含む、８又は９に記載の方法。
［１１］３から７のいずれか１項に記載のプライマーセットを用い、制限酵素がMspIである、１０に記載の方法。
【００１０】
［１２］ LAMP法に用いられる、１若しくは２に記載のオリゴヌクレオチド、又は３から７のいずれか１項に記載のプライマーセット。
［１３］１若しくは２に記載のオリゴヌクレオチド、又は３から７のいずれか１項に記載のプライマーセットを含む、ネギ黒腐菌核病の診断のためのキット。
［１４］下記(e)-(ｊ)のオリゴヌクレオチドを含む、ネギ黒腐菌核病の診断のためのLAMP法プライマーセット。
(e) 配列番号83の配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであるFIP
(f) 配列番号84の配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであるBIP
(g) 配列番号85の配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであるF3プライマー
(h) 配列番号86の配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであるB3プライマー
(i) 配列番号87の配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであるLF
(j)配列番号88の配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであるLB
【発明の効果】
（【００１１】以降は省略されています）

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