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公開番号2025168433
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-11-07
出願番号2025139737,2022521299
出願日2025-08-25,2020-10-08
発明の名称高頻度標的化動物遺伝子導入
出願人ザジャクソンラボラトリー,THE JACKSON LABORATORY
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/09 20060101AFI20251030BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】高頻度標的化動物遺伝子導入の提供。
【解決手段】本開示は、例えば、Bxb1ランディングパッドを使用する、高頻度マウス遺伝子導入のための方法および組成物を提供する。本開示は、マウスゲノムへの外因性DNAの大きな単一コピー挿入が、Bxb1インテグラーゼシステムを使用して達成可能であることを示す。従って、本明細書で提供されるのは、いくつかの局面において、遺伝子編集ツール(例えば、CRISPR/Cas9)およびBxb1インテグラーゼの組み合わせを利用して、特異的遺伝子座への大きな導入遺伝子の単一コピーを挿入するシステムである。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
明細書に記載の発明。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１９年１０月９日出願の米国仮特許出願第６２／９１３，０９２号（これは、その全体において本明細書に参考として援用される）の利益を主張する。
続きを表示（約 3,100 文字）【０００２】
政府資金提供の研究
本発明は、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈによって授与されたＲ２４ＯＤ０１６４７３およびＲ２１ＯＤ０２３８００の下で政府支援を得て行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ゲノム工学の革命は、マウスゲノムの迅速な改変を推進し続けており、これまでより速く、的確に複雑な変異マウス系統を作り出している。小さなゲノム改変は、単純かつ効率的であるが、大きなドナーＤＮＡの正確な挿入のための相同組換えに対する信頼性は、問題のあるままである。ヒト化マウスの作製は、その意図した発現パターンおよび機能を再現するために、遺伝子の制御領域の組み込みを必要とする。これは、ランダムかつ本質的には無秩序な遺伝子導入の使用に関する１つの理由であり、これにより、低い効率、部分的／不完全な組み込み、およびマルチコピーコンカテマー化に悩まされ得る。このような挿入はしばしば、活性な遺伝子座に置かれ、導入遺伝子発現に対する有害な位置効果および意図せず破壊された内因性遺伝子（複数可）を生じる。結論として、大きなトランスジェニックプロジェクトはしばしば、実質的な特徴付けの時間および余分な回数の繁殖を必要とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
要旨
本開示は、マウスゲノムへの外因性ＤＮＡの大きな単一コピー挿入が、Ｂｘｂ１インテグラーゼシステムを使用して達成可能であることを示す。従って、本明細書で提供されるのは、いくつかの局面において、遺伝子編集ツール（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）およびＢｘｂ１インテグラーゼの組み合わせを利用して、特異的遺伝子座への大きな導入遺伝子の単一コピーを挿入するシステムである。Ｂｘｂ１インテグラーゼの存在下では、ａｔｔＰ部位をａｔｔＢ部位で組み換えて、上記部位をａｔｔＲ（「右側」）およびａｔｔＬ（「左型」）部位へと変換する（図１）。このシステムは、いくつかの実施形態において、ゲノムへのプラスミド／細菌ドナーＤＮＡベクター配列組み込み（これは、導入遺伝子サイレンシングを生じることが示されている）を排除する。本明細書において、３０．６キロベース（ｋｂ）のヒトＤＮＡを、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスＲｏｓａ２６遺伝子座へと、１１％効率（４／３５）で組み込んだ。驚くべきことに、全４つの独立した系（line）が、マイクロインジェクションの日から３～６ヶ月以内に、オフターゲット汚染（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）のないトランスジェニックアレルの生殖細胞系列伝達を示した。さらに、上記遺伝子は、肝臓において適切に転写される。これらの結果は、このシステムが、無傷の単一コピーの導入遺伝子を、短期間で規定の遺伝子座の中に送達する能力を示し、これは、正確な遺伝子導入、すなわち、動物モデルの迅速かつ信頼性の高い遺伝子工学のための強力なツールを提供する。
【０００５】
本開示は、いくつかの局面において、ゲノムの制限されたオフターゲット改変を有する、動物（例えば、哺乳動物、例えば、齧歯類、例えば、マウス）のゲノムにおいて、大きな導入遺伝子（例えば、少なくとも２０キロベースの長さ）の標的化挿入のための方法を提供する。驚くべきことに、Ｂｘｂ１ａｔｔ（付着部位）ランディングパッドを有するように遺伝子操作されたマウスは、高い挿入頻度で大きな導入遺伝子の挿入を可能にする。さらに、上記Ｂｘｂ１システムは、特に、マウスゲノムにおいて偽組み込み部位を示すことは知られていない（例えば、ＲｕｓｓｅｌｌＪＰら．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２００６；４０：４６０－４６４を参照のこと）。
【０００６】
いくつかの実施形態において、本開示のＢｘｂ１ランディングパッドマウス系統は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（またはそのバリアントもしくはホモログ）をコードするポリヌクレオチド、ゲノム遺伝子座（例えば、セーフハーバー遺伝子座）（例えば、Ｒｏｓａ２６またはＨｉｐ１１遺伝子座）を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、およびセーフハーバー遺伝子座に対する相同性アームに挟まれているＢｘｂ１付着部位（複数可）を含む（少なくとも１つの）１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集ツールの前核マイクロインジェクションを通じて、マウスにおいて直接生成される。例えば、これらのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集ツールの使用は、ゲノムにおいて（意図したゲノム遺伝子座を除いて）オフターゲット変化がほとんどないし全くないマウス系／系統を生じる。その樹立されたＢｘｂ１ランディングパッドマウス系は、次いで、目的の導入遺伝子の挿入およびその後の分析のためのプラットフォームとして使用され得る。例えば、目的の導入遺伝子および相当する（同族の）Ｂｘｂ１付着部位（複数可）を含むドナーＤＮＡを、Ｂｘｂ１インテグラーゼ（またはＢｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチド）をマイクロインジェクションして、ゲノムに組み込まれた目的の導入遺伝子を有するトランスジェニックマウスを産生することができる。
【０００７】
本開示のいくつかの局面は、そのゲノム（例えば、ゲノム遺伝子座）内に第１のＢｘｂ１付着部位（例えば、ａｔｔＰまたはａｔｔＢ）および第２のＢｘｂ１付着部位（例えば、改変されたａｔｔＰ
＊
または改変されたａｔｔＢ
＊
）を含む哺乳動物（または他の動物）を提供する。いくつかの実施形態において、上記哺乳動物は、Ｂｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。上記ポリヌクレオチドは、例えば、第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位に挟まれ得る。従って、上記Ｂｘｂ１インテグラーゼは、ゲノムによってコードされ得る。
【０００８】
本開示の他の局面は、そのゲノム（例えば、ゲノム遺伝子座）内に第１のＢｘｂ１付着部位および第２のＢｘｂ１付着部位を含む哺乳動物胚（または他の動物胚）を提供する。いくつかの実施形態において、上記哺乳動物胚は、Ｂｘｂ１インテグラーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで必要に応じて上記ポリヌクレオチドは、上記第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位に挟まれている。
【０００９】
いくつかの実施形態において、第１のＢｘｂ１付着部位は、ａｔｔＰ部位、改変されたａｔｔＰ
＊
部位、ａｔｔＢ部位、および改変されたａｔｔＢ
＊
部位から選択される。いくつかの実施形態において、第２のＢｘｂ１付着部位は、ａｔｔＰ部位、改変されたａｔｔＰ
＊
部位、ａｔｔＢ部位、および改変されたａｔｔＢ
＊
部位から選択される。いくつかの実施形態において、第１のおよび第２のＢｘｂ１付着部位は、互いに対して異種である。
【００１０】
いくつかの実施形態において、ａｔｔＰ部位は、配列番号１の配列を含む。いくつかの実施形態において、改変されたａｔｔＰ
＊
部位は、配列番号７の配列を含む。いくつかの実施形態において、ａｔｔＢ部位は、配列番号２の配列を含む。いくつかの実施形態において、改変されたａｔｔＢ
＊
部位は、配列番号８の配列を含む。
（【００１１】以降は省略されています）

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