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公開番号2025157268
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-10-15
出願番号2025107892,2022525363
出願日2025-06-26,2020-10-30
発明の名称V型CRISPR-CAS塩基エディタおよびその使用方法
出願人ペアーワイズプランツサービシズ, インコーポレイテッド
代理人個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/09 20060101AFI20251007BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】標的核酸を改変する方法を提供する。
【解決手段】標的核酸を、(a)V型CRISPR-Casエフェクタータンパク質;(b)デアミナーゼ(ここで標的核酸は、2以上のデアミナーゼと接触されてもよい);および(c)ガイド核酸と接触させるステップを含み、デアミナーゼは、V型CRISPR-Casエフェクタータンパク質へ動員され(例えば、タンパク質間相互作用、RNAとタンパク質の間の相互作用、および/または化学的相互作用を介して動員される)、それにより標的核酸を改変し、ここで、V型CRISPR-Casエフェクタータンパク質、デアミナーゼおよびガイド核酸は、同時発現されてもよい。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
標的核酸を改変する方法であって、
前記方法は、
前記標的核酸を、以下：
（ａ）Ｖ型ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）エフェクタータンパク質；
（ｂ）デアミナーゼ、
ここで前記標的核酸は２以上のデアミナーゼと接触されてもよい；
および
（ｃ）ガイド核酸
と接触させるステップを含み、
ここで前記デアミナーゼは、前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質へ動員され（例えば、タンパク質間相互作用、ＲＮＡとタンパク質の間の相互作用、および／または化学的相互作用を介して動員される）、それにより前記標的核酸を改変し、ここで前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質、前記デアミナーゼおよびガイド核酸は、同時発現されてもよい、
方法。
続きを表示（約 2,300 文字）【請求項２】
標的核酸を改変する方法であって、
前記方法は、
前記標的核酸を、以下：
（ａ）ペプチドタグに融合されたＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質を含む、Ｖ型ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）融合タンパク質；
（ｂ）前記ペプチドタグに結合する親和性ポリペプチドに融合されたデアミナーゼを含む、デアミナーゼ融合タンパク質、
ここで前記標的核酸は、２以上のデアミナーゼ融合タンパク質と接触されてもよい；
および
（ｃ）ガイド核酸
と接触させるステップを含み、
ここで前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ融合タンパク質、前記デアミナーゼ融合タンパク質およびガイド核酸は同時発現されてもよく、それにより前記標的核酸を改変する、
方法。
【請求項３】
標的核酸を改変する方法であって、
前記方法は、
前記標的核酸を、以下：
（ａ）ペプチドタグに結合する親和性ポリペプチドに融合されたＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質を含む、Ｖ型ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）融合タンパク質；
（ｂ）前記ペプチドタグに融合されたデアミナーゼを含む、デアミナーゼ融合タンパク質、
ここで前記標的核酸は、２以上のデアミナーゼ融合タンパク質と接触されてもよい；
および
（ｃ）ガイド核酸
と接触させるステップを含み、
ここで前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ融合タンパク質、前記デアミナーゼ融合タンパク質およびガイド核酸は同時発現されてもよく、それにより前記標的核酸を改変する、
方法。
【請求項４】
標的核酸を改変する方法であって、
前記方法は、
前記標的核酸を、以下：
（ａ）Ｖ型ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）エフェクタータンパク質；
（ｂ）ＲＮＡ動員モチーフに連結されたガイドＲＮＡを含む、動員ガイド核酸、および
（ｃ）前記ＲＮＡ動員モチーフに結合する親和性ポリペプチドに融合されたデアミナーゼを含む、デアミナーゼ融合タンパク質、
ここで前記標的核酸は、２以上のデアミナーゼ融合タンパク質と接触されてもよい；
と接触させるステップを含み、
ここで前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質、前記デアミナーゼ融合タンパク質および前記動員ガイド核酸は同時発現されてもよく、それにより前記標的核酸を改変する、
方法。
【請求項５】
前記ペプチドタグが２以上のコピーの前記ペプチドタグ（例えば、２以上のエピトープ）を含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチドタグが、ＧＣＮ４ペプチド繰り返し単位（例えば、Ｓｕｎ－Ｔａｇ）、ｃ－Ｍｙｃ親和性タグ、ＨＡ親和性タグ、Ｈｉｓ親和性タグ、Ｓ親和性タグ、メチオニン－Ｈｉｓ親和性タグ、ＲＧＤ－Ｈｉｓ親和性タグ、ＦＬＡＧオクタペプチド、ｓｔｒｅｐタグまたはｓｔｒｅｐタグＩＩ、Ｖ５タグ、および／またはＶＳＶ－Ｇエピトープである、請求項２、３または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記親和性ポリペプチドが抗体である、請求項２、３、５、または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体がｓｃＦｖ抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記動員ガイド核酸が２以上のＲＮＡ動員モチーフに連結されており、ここで前記２以上のＲＮＡ動員モチーフは、同一のＲＮＡ動員モチーフまたは異なるＲＮＡ動員モチーフであってもよい、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＮＡ動員モチーフがテロメラーゼＫｕ結合モチーフ（例えば、Ｋｕ結合ヘアピン）であり前記親和性ポリペプチドがＫｕポリペプチド（例えば、Ｋｕヘテロ二量体）である；前記ＲＮＡ動員モチーフがテロメラーゼＳｍ７結合モチーフであり前記親和性ポリペプチドがＳｍ７ポリペプチドである；前記ＲＮＡ動員モチーフがＭＳ２ファージオペレーターステムループであり前記親和性ポリペプチドがＭＳ２Ｃｏａｔタンパク質（ＭＣＰ）である；前記ＲＮＡ動員モチーフがＰＰ７ファージオペレーターステムループであり前記親和性ポリペプチドがＰＰ７Ｃｏａｔタンパク質（ＰＣＰ）である；前記ＲＮＡ動員モチーフがＳｆＭｕファージＣｏｍステムループであり前記親和性ポリペプチドがＣｏｍＲＮＡ結合タンパク質である；前記ＲＮＡ動員モチーフがＰｕｍｉｌｉｏ／ｆｅｍ－３ｍＲＮＡ結合因子（ＰＵＦ）であり前記親和性ポリペプチドがＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）ポリペプチドである；および／または、前記ＲＮＡ動員モチーフが合成ＲＮＡアプタマーであり前記親和性ポリペプチドが対応するアプタマーリガンドである、請求項４または９に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
［配列リストの電子出願に関する陳述］
連邦規則法典第３７巻１．８２１条の下で提出されたＡＳＣＩＩテキスト形式の配列リストであって、２０２０年１０月３０日に作成されてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された、３５１，９９９バイトのサイズの１４９９－１０ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと題されたものは、紙のコピーの代わりに提供される。この配列リストは、その開示に関して参照により本明細書中に援用される。
続きを表示（約 2,200 文字）【０００２】
［本発明の分野］
本発明は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質、デアミナーゼ、ならびにその融合および動員核酸構築物に関する。本発明はさらに、それを利用した標的化核酸改変の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子編集は、標的化されたゲノム位置においてバリエーションを導入するために部位特異的ヌクレアーゼを利用するプロセスである。ＣからＴへの塩基編集は、標的化モジュールとしてＣａｓ９を用いる塩基エディタによって達成され得る。例えば、Ｋｏｍｏｒｅｔａｌ．（ＳｃｉＡｄｖａｎｃｅｓ３（８）：ｅａａｏ４７７４）（２０１７））およびＫｏｂｌａｎｅｔａｌ．（ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３６（９）：８４３－８４６（２０１８）は、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼ、Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）、および２コピーのウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）を含む融合タンパク質としてＣａｓ９を用いる塩基エディタを開示している。Ｌｉｅｔａｌ．（ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６（４）：３２４－３２７（２０１８））は、Ｃａｓ９を不活性化Ｃｐｆ１で置き換えている。ヒト細胞において活性であるが、このＣｐｆ１構築物は、そのＣａｓ９相対物よりも効率が低い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
塩基編集を、植物を含むより多数の生物にわたってより有用にさせるために、新たな塩基編集ツールが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の１つの態様は、標的核酸を改変する方法を提供し、その方法は、標的核酸を、（ａ）Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質；（ｂ）デアミナーゼ（ここで標的核酸は、２以上のデアミナーゼと接触されてもよい）；および（ｃ）ガイド核酸と接触させるステップを含み、デアミナーゼは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質へ動員され（例えば、タンパク質間相互作用、ＲＮＡとタンパク質の間の相互作用、および／または化学的相互作用を介して動員される）、それにより標的核酸を改変し、ここで、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質、デアミナーゼおよびガイド核酸は、同時発現されてもよい。
【０００６】
本発明の第２の態様は、標的核酸を改変するステップを提供し、その方法は、標的核酸を、（ａ）ペプチドタグ（例えば、エピトープまたは多量体化エピトープ）に融合されたＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質を含む、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ融合タンパク質；（ｂ）ペプチドタグに結合する親和性ポリペプチドに融合されたデアミナーゼを含む、デアミナーゼ融合タンパク質（標的核酸は、２以上のデアミナーゼ融合タンパク質と接触されてもよい）；および（ｃ）ガイド核酸と接触させるステップを含み、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ融合タンパク質、デアミナーゼ融合タンパク質およびガイド核酸は同時発現されてもよく、それにより標的核酸を改変する。
【０００７】
本発明の第３の態様は、標的核酸を改変する方法を提供し、その方法は、標的核酸を、（ａ）ペプチドタグに結合する親和性ポリペプチドに融合されたＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質を含む、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ融合タンパク質；（ｂ）ペプチドタグ（例えば、エピトープまたは多量体化エピトープ）に融合されたデアミナーゼを含む、デアミナーゼ融合タンパク質（標的核酸は、２以上のデアミナーゼ融合タンパク質と接触されてもよい）；および（ｃ）ガイド核酸と接触させるステップを含み、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ融合タンパク質、デアミナーゼ融合タンパク質およびガイド核酸は同時発現されてもよく、それにより標的核酸を改変する。
【０００８】
第４の態様は、標的核酸を改変する方法を提供し、その方法は、標的核酸を、（ａ）Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質；（ｂ）ＲＮＡ動員モチーフに連結されたガイド核酸を含む、動員ガイド核酸、および（ｃ）ＲＮＡ動員モチーフに結合する親和性ポリペプチドに融合されたデアミナーゼを含む、デアミナーゼ融合タンパク質（標的核酸は、２以上のデアミナーゼ融合タンパク質と接触されてもよい）と接触させるステップを含み；Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質、デアミナーゼ融合タンパク質および動員ガイド核酸は同時発現されてもよく、それにより標的核酸を改変する。
【０００９】
本発明の第５の態様は、（ａ）ペプチドタグに融合されたＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質を含む、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ融合タンパク質；（ｂ）ペプチドタグに結合する親和性ポリペプチドに融合されたデアミナーゼを含む、デアミナーゼ融合タンパク質；および（ｃ）ガイド核酸を含む、核酸構築物を提供する。
【００１０】
本発明の第６の態様は、（ａ）Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質；（ｂ）ＲＮＡ動員モチーフに連結されたガイド核酸を含む、動員ガイド核酸；および（ｃ）ＲＮＡ動員モチーフに結合する親和性ポリペプチドに融合されたデアミナーゼを含む、デアミナーゼ融合タンパク質を含む、核酸構築物を提供する。
（【００１１】以降は省略されています）

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