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公開番号2025143955
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-10-02
出願番号2024043486
出願日2024-03-19
発明の名称エチレングリコール産生遺伝子組換え微生物、およびエチレングリコールの製造方法
出願人シーシーアイホールディングス株式会社,国立大学法人神戸大学
代理人弁理士法人お茶の水内外特許事務所
主分類C12N 1/21 20060101AFI20250925BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】新規なエチレングリコール産生遺伝子組換え微生物と、この遺伝子組換え微生物を用いたエチレングリコールの製造方法を提供すること。
【解決手段】下記変換経路に基づいて、グリセロールからエチレングリコールを製造可能である遺伝子組換え微生物、およびこの遺伝子組換え微生物をグリセロールを含む培地で培養し、グリセロールからエチレングリコールを製造するエチレングリコールの製造方法。
【化1】
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特許請求の範囲【請求項１】
下記変換経路に基づいて、グリセロールからエチレングリコールを製造可能であることを特徴とする遺伝子組換え微生物。
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続きを表示（約 1,900 文字）【請求項２】
グリセロールを、グリセルアルデヒドを介してグリセリン酸に変換する酵素Ａ
グリセリン酸を、ヒドロキシピルビン酸に変換する酵素Ｃ
ヒドロキシピルビン酸を、グリコールアルデヒドに変換する酵素Ｄ
をコードするＤＮＡが導入されていることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子組換え微生物。
【請求項３】
酵素Ａが、下記酵素群Ａから選ばれる酵素の１以上
酵素Ｃが、下記酵素群Ｃから選ばれる酵素の１以上
酵素Ｄが、下記酵素群Ｄから選ばれる酵素の１以上
であることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子組換え微生物。
酵素群Ａ：配列番号１～２９に示すアミノ酸配列、または配列番号１～２９に示す配列との配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を有する酵素
酵素群Ｃ：配列番号６７～８０のいずれかに示すアミノ酸配列、または配列番号６７～８０に示す配列との配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を有する酵素
酵素群Ｄ：配列番号８１～１０６のいずれかに示すアミノ酸配列、または配列番号８１～１０６に示す配列との配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を有する酵素
【請求項４】
酵素Ａが、ＡｒｄＡｌｄＯ（配列番号１）、
酵素Ｃが、ＦｔＬｏｘ（配列番号６７）、
酵素Ｄが、ＫｓｍｄｌＣ（配列番号８１）、
であることを特徴とする請求項３に記載の遺伝子組換え微生物。
【請求項５】
グリセルアルデヒドを、グリセリン酸に変換する酵素Ｂ、
グリコールアルデヒドを、エチレングリコールに変換する酵素Ｅ
をコードするＤＮＡが導入されていることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子組換え微生物。
【請求項６】
酵素Ｂが、下記酵素群Ｂから選ばれる酵素の１以上
酵素Ｅが、下記酵素群Ｅから選ばれる酵素の１以上
であることを特徴とする請求項５に記載の遺伝子組換え微生物。
酵素群Ｂ：配列番号４４～６６のいずれかに示すアミノ酸配列、または配列番号４４～６６に示す配列との配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を有する酵素
酵素群Ｅ：配列番号１０７～１１７のいずれかに示すアミノ酸配列、または配列番号１０７～１１７に示す配列との配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を有する酵素
【請求項７】
前記酵素群Ｂから選ばれる酵素が、ＫｐｐｕｕＣ（配列番号４４）、
前記酵素群Ｅから選ばれる酵素が、ＥｃｆｕｃＯ（配列番号１０７）、
であることを特徴とする請求項６に記載の遺伝子組換え微生物。
【請求項８】
グリセロールを、グリセルアルデヒドに変換する酵素Ａ２
グリセルアルデヒドを、グリセリン酸に変換する酵素Ｂ
グリセリン酸を、ヒドロキシピルビン酸に変換する酵素Ｃ
ヒドロキシピルビン酸を、グリコールアルデヒドに変換する酵素Ｄ
をコードするＤＮＡが導入されていることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子組換え微生物。
【請求項９】
酵素Ａ２が、下記酵素群Ａ２から選ばれる酵素の１以上
酵素Ｂが、下記酵素群Ｂから選ばれる酵素の１以上
酵素Ｃが、下記酵素群Ｃから選ばれる酵素の１以上
酵素Ｄが、下記酵素群Ｄから選ばれる酵素の１以上
であることを特徴とする請求項８に記載の遺伝子組換え微生物。
酵素群Ａ２：配列番号３０～４３のいずれかに示すアミノ酸配列、または配列番号３０～４３に示す配列との配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を有する酵素
酵素群Ｂ：配列番号４４～６６のいずれかに示すアミノ酸配列、または配列番号４４～６６に示す配列との配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を有する酵素
酵素群Ｃ：配列番号６７～８０のいずれかに示すアミノ酸配列、または配列番号６７～８０に示す配列との配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を有する酵素
酵素群Ｄ：配列番号８１～１０６のいずれかに示すアミノ酸配列、または配列番号８１～１０６に示す配列との配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を有する酵素
【請求項１０】
酵素Ａ２が、ＣｂＡｌｄＯ（配列番号３０）、
酵素Ｂが、ＫｐｐｕｕＣ（配列番号４４）、
酵素Ｃが、ＦｔＬｏｘ（配列番号６７）、
酵素Ｄが、ＫｓｍｄｌＣ（配列番号８１）、
であることを特徴とする請求項９に記載の遺伝子組換え微生物。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、エチレングリコールを産生する遺伝子組換え微生物と、この遺伝子組換え微生物を用いたエチレングリコールの製造方法に関する。
続きを表示（約 4,600 文字）【背景技術】
【０００２】
エチレングリコールは、構造式「ＨＯＣＨ
２
ＣＨ
２
ＯＨ」で表される２価のアルコールであり、ポリエステル等の合成原料や、溶媒、不凍液等として広く用いられている。エチレングリコールは、工業的には、原油からエチレンを得て、エチレンを酸化してエチレンオキシドとし、これを水和することにより製造されているが、その製造プロセスでは、大量のエネルギーと水を必要とする。
近年、地球温暖化等の環境への悪影響を小さくすることが強く要求されており、エチレングリコールについても、製造時の環境負荷低減が求められている。その手段の一つとして、微生物によるエチレングリコールが提案されており、例えば、特許文献１には、一酸化炭素、二酸化炭素、水素の１以上を含むガス状基質からエチレングリコールを生成できる遺伝子操作された微生物が提案されている。特許文献１に記載されている遺伝子操作された微生物によるエチレングリコールの生産量は培養２０日で２．４ｍｇ／Ｌ程度が最大であり（図３Ｂ参照）、生産性に優れているとは言い難かった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
特表２０２１－５０６２４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、新規なエチレングリコール産生遺伝子組換え微生物と、この遺伝子組換え微生物を用いたエチレングリコールの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の課題を解決するための手段は以下の通りである。
１．下記変換経路に基づいて、グリセロールからエチレングリコールを製造可能であることを特徴とする遺伝子組換え微生物。
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２．グリセロールを、グリセルアルデヒドを介してグリセリン酸に変換する酵素Ａ
グリセリン酸を、ヒドロキシピルビン酸に変換する酵素Ｃ
ヒドロキシピルビン酸を、グリコールアルデヒドに変換する酵素Ｄ
をコードするＤＮＡが導入されていることを特徴とする１．に記載の遺伝子組換え微生物。
３．酵素Ａが、下記酵素群Ａから選ばれる酵素の１以上
酵素Ｃが、下記酵素群Ｃから選ばれる酵素の１以上
酵素Ｄが、下記酵素群Ｄから選ばれる酵素の１以上
であることを特徴とする２．に記載の遺伝子組換え微生物。
酵素群Ａ：配列番号１～２９に示すアミノ酸配列、または配列番号１～２９に示す配列との配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を有する酵素
酵素群Ｃ：配列番号６７～８０のいずれかに示すアミノ酸配列、または配列番号６７～８０に示す配列との配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を有する酵素
酵素群Ｄ：配列番号８１～１０６のいずれかに示すアミノ酸配列、または配列番号８１～１０６に示す配列との配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を有する酵素
４．酵素Ａが、ＡｒｄＡｌｄＯ（配列番号１）、
酵素Ｃが、ＦｔＬｏｘ（配列番号６７）、
酵素Ｄが、ＫｓｍｄｌＣ（配列番号８１）、
であることを特徴とする３．に記載の遺伝子組換え微生物。
５．グリセルアルデヒドを、グリセリン酸に変換する酵素Ｂ、
グリコールアルデヒドを、エチレングリコールに変換する酵素Ｅ
をコードするＤＮＡが導入されていることを特徴とする２．～４．のいずれかに記載の遺伝子組換え微生物。
６．酵素Ｂが、下記酵素群Ｂから選ばれる酵素の１以上
酵素Ｅが、下記酵素群Ｅから選ばれる酵素の１以上
であることを特徴とする５．に記載の遺伝子組換え微生物。
酵素群Ｂ：配列番号４４～６６のいずれかに示すアミノ酸配列、または配列番号４４～６６に示す配列との配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を有する酵素
酵素群Ｅ：配列番号１０７～１１７のいずれかに示すアミノ酸配列、または配列番号１０７～１１７に示す配列との配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を有する酵素
７．前記酵素群Ｂから選ばれる酵素が、ＫｐｐｕｕＣ（配列番号４４）、
前記酵素群Ｅから選ばれる酵素が、ＥｃｆｕｃＯ（配列番号１０７）、
であることを特徴とする６．に記載の遺伝子組換え微生物。
８．グリセロールを、グリセルアルデヒドに変換する酵素Ａ２
グリセルアルデヒドを、グリセリン酸に変換する酵素Ｂ
グリセリン酸を、ヒドロキシピルビン酸に変換する酵素Ｃ
ヒドロキシピルビン酸を、グリコールアルデヒドに変換する酵素Ｄ
をコードするＤＮＡが導入されていることを特徴とする１．に記載の遺伝子組換え微生物。
９．酵素Ａ２が、下記酵素群Ａ２から選ばれる酵素の１以上
酵素Ｂが、下記酵素群Ｂから選ばれる酵素の１以上
酵素Ｃが、下記酵素群Ｃから選ばれる酵素の１以上
酵素Ｄが、下記酵素群Ｄから選ばれる酵素の１以上
であることを特徴とする８．に記載の遺伝子組換え微生物。
酵素群Ａ２：配列番号３０～４３のいずれかに示すアミノ酸配列、または配列番号３０～４３に示す配列との配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を有する酵素
酵素群Ｂ：配列番号４４～６６のいずれかに示すアミノ酸配列、または配列番号４４～６６に示す配列との配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を有する酵素
酵素群Ｃ：配列番号６７～８０のいずれかに示すアミノ酸配列、または配列番号６７～８０に示す配列との配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を有する酵素
酵素群Ｄ：配列番号８１～１０６のいずれかに示すアミノ酸配列、または配列番号８１～１０６に示す配列との配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を有する酵素
１０．酵素Ａ２が、ＣｂＡｌｄＯ（配列番号３０）、
酵素Ｂが、ＫｐｐｕｕＣ（配列番号４４）、
酵素Ｃが、ＦｔＬｏｘ（配列番号６７）、
酵素Ｄが、ＫｓｍｄｌＣ（配列番号８１）、
であることを特徴とする９．に記載の遺伝子組換え微生物。
１１．グリコールアルデヒドを、エチレングリコールに変換する酵素Ｅ
をコードするＤＮＡが導入されていることを特徴とする８．～１０．のいずれかに記載の遺伝子組換え微生物。
１２．酵素Ｅが、下記酵素群Ｅから選ばれる酵素の１以上
【発明の効果】
【０００６】
本発明の遺伝子組換え微生物は、グリセロール（グリセリン）を出発物質としてエチレングリコールを製造することができる。グリセロールは、水への溶解度が高く（２４．４ｇ／１００ｍｌ水、２０℃）、２０％の高濃度でも微生物を培養することができるため、培養液のグリセロール濃度を高くすることができ、エチレングリコールを効率的に製造することができる。
グリセロールは、生物由来の油脂（トリアシルグリセリド）から得ることができるため、生物由来のグリセロールを出発物質とすることにより、生物由来のエチレングリコールを製造することができる。グリセロールは、化学反応の副生成物として大量に生じるが、その多くが廃棄されているため、廃棄されるグリセロールを原料としてエチレングリコールを製造することで、グリセロールの廃棄量を減らすことができ、また、これまで、焼却等によるグリセロールの廃棄処分時に生じる二酸化炭素量を低減することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
「遺伝子組換え微生物」
本発明の遺伝子組換え微生物は、以下に示す変換経路に基づいて、グリセロールからエチレングリコールを製造することができる。
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【０００８】
微生物に、上記変換経路に示すＳｔｅｐ１～５の変換を行う酵素をコードするＤＮＡを導入することにより、本発明の遺伝子組換え微生物を得ることができる。
本発明の遺伝子組換え微生物において、遺伝子組換えを行う微生物は特に制限されず、酵母、大腸菌、乳酸菌、枯草菌、放線菌、コリネ型細菌、シュードモナス型細菌等が挙げられ、形質転換および培養が容易なため、酵母、大腸菌が好ましい。酵母としては、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ブレタノミセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、カンジタ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クロッケラ属（Ｋｌｏｃｃｋｅｒａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、イサトケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、スワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ヤマダジマ属（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）、パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）等が挙げられ、具体的には、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ等が挙げられる。大腸菌としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ等が挙げられる。
【０００９】
本発明の第一実施態様である遺伝子組換え微生物は、グリセロールをグリセルアルデヒドを介してグリセリン酸に変換する酵素Ａ（Ｓｔｅｐ１、２）、グリセリン酸をヒドロキシピルビン酸に変換する酵素Ｃ（Ｓｔｅｐ３）、ヒドロキシピルビン酸をグリコールアルデヒドに変換する酵素Ｄ（Ｓｔｅｐ４）、のそれぞれをコードするＤＮＡが導入されている。なお、Ｓｔｅｐ５の変換を行う酵素は、微生物が生来有している。
【００１０】
酵素Ａとしては、グリセロールをグリセルアルデヒドを介してグリセリン酸に変換するものであれば特に制限されないが、例えば、表１に示す酵素群Ａに属する配列番号１～２０に示す酸化酵素、配列番号２１～２５に示すアルコール酸化酵素、配列番号２６～２９に示すアルコール脱水素酵素、または配列番号１～２９に示す配列との配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を有する酵素が挙げられ、これらの１種の酵素または２種以上の酵素をコードするＤＮＡを導入することができる。これらの中で、ＡｒｄＡｌｄＯ（配列番号１）が、高い活性値を示すため好ましい。
（【００１１】以降は省略されています）

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