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公開番号2025118760
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-08-13
出願番号2025076490,2022527956
出願日2025-05-02,2020-11-12
発明の名称細胞の選択方法
出願人ロンザリミテッド,LONZA LIMITED
代理人個人,個人
主分類C12N 5/10 20060101AFI20250805BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】特定の核酸配列を含む細胞を特定、選択、または培養するための方法および組成物を提供する。
【解決手段】生産細胞、および機能的N末端調節ドメインを欠くフェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)をコードする配列と、GTPシクロヒドロラーゼ1(GCH1)をコードする配列との組み合わせに基づいて、チロシン栄養要求性選択マーカー系を含む生産細胞を特定、選択、または培養するための方法が提供される。生産細胞を作製し、当該生産細胞で産物を作製する方法も提供される。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
目的の産物をコードする核酸配列を含む真核細胞を選択する方法であって、
ｉ）チロシンの不在下で生存または増殖することができない細胞集団を、ベクター系と接触させることであって、前記ベクター系が、
ａ）宿主細胞におけるフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の発現を可能にする第１の制御配列に作動可能に連結された、機能的Ｎ末端調節ドメインを欠く前記ＰＡＨをコードする配列を含む、第１の核酸配列と、
（ｂ）宿主細胞におけるＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）の発現を可能にする第２の制御配列に作動可能に連結された、前記ＧＣＨ１をコードする配列を含む、第２の核酸配列と、
（ｃ）宿主細胞における目的の産物の発現を可能にする第３の制御配列に作動可能に連結された、前記産物をコードする配列を含む、第３の核酸配列と、を含み、前記第３の配列が、（ａ）および／または（ｂ）と同じベクター中に、前記細胞による前記ベクター系の取り込みを可能にする条件下で存在することと、
ｉｉ）前記チロシンのレベルが前記ベクター系によってコードされる前記ＰＡＨおよびＧＣＨ１酵素を発現しない細胞の生存または増殖に必要なレベルよりも低い条件下で、前記細胞を培養することと、
ｉｉｉ）そのような条件下で増殖することができる１つ以上の細胞を選択して、前記産物をコードする前記核酸配列を含有する１つ以上の細胞を得ることと、を含む、方法。
続きを表示（約 860 文字）【請求項２】
（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、同じベクター中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｃ）が、（ａ）または（ｂ）と同じベクター中に存在する、２つのベクターを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記真核細胞が、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ細胞である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＡＨが、前記Ｎ末端調節ドメインの欠失を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６】
前記細胞培養培地が、チロシンを欠き、任意選択で、フェニルアラニンを補充される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
真核宿主細胞であって、
ａ）宿主細胞におけるフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の発現を可能にする第１の制御配列に作動可能に連結された、機能的Ｎ末端調節ドメインを欠く前記ＰＡＨをコードする配列を含む、第１の外因性核酸と、
ｂ）前記宿主細胞におけるＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）の発現を可能にする第２の制御配列に作動可能に連結された、前記ＧＣＨ１をコードする、第２の外因性核酸と、
ｃ）前記宿主細胞における目的の産物の発現を可能にする第３の制御配列に作動可能に連結された、前記産物をコードする第３の外因性核酸と、を含み、前記第３の外因性核酸が、前記第１および／または第２の外因性核酸と同じ外因性核酸配列中に存在する、真核宿主細胞。
【請求項８】
前記ＰＡＨが、前記Ｎ末端調節ドメインの欠失を有する、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記ＰＡＨが、ＣＨＯまたはヒトＰＡＨである、請求項７または８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞である、請求項７～９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本開示は、主題の核酸配列を含む細胞を特定、選択、または培養するための方法および組成物に関する。
続きを表示（約 2,300 文字）【背景技術】
【０００２】
細胞発現系は、治療用生物製剤などの組換え生物学的産物の産生に一般的に使用される。生産ライン細胞の開発は、目的の組換え産物をコードする核酸構築物を宿主細胞に導入し、これらの核酸構築物を含有する細胞を選択することを伴う。これは、概して、外来核酸を取り込んだ細胞が優先されるように、細胞を選択圧にさらすことを伴う。初期の選択可能なマーカー系は、抗生物質耐性マーカーを使用したが、そのような系の使用から離れる傾向にあった。いくつかの代替の系は、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびグルタミン合成酵素（ＧＳ）の代謝欠損の補完に基づいている。しかしながら、組換え生物学的産物を産生するために使用される細胞を選択するために使用することができる新しい選択系の必要性が依然として存在する。さらに、生産宿主細胞工学戦略がますます使用されているため、宿主細胞の特徴を修飾する新しい配列の導入を伴うそれらの戦略は、生物学的産物をコードする配列の導入に使用される既存のまたは今後の選択系とは別の選択系から利益を得るであろう。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、チロシン栄養要求性に基づく選択系、および培地中にチロシンを含む必要がない組換え産物の製造に関する。フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ－フェニルアラニンのチロシンへの変換を触媒する）のみに基づく系は効果的ではなく、チロシン生合成に関連する第２の酵素、すなわち、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）を含むことが必要であることが分かった。さらに、Ｎ末端調節ドメインを除去する切断とともにＰＡＨを使用することは、完全長酵素と比較して顕著な利点を提供することが分かった。完全長ＣＨＯＰＡＨを使用すると、トランスフェクション後にチロシン不含培地で回復しなかったか、または回復時間がはるかに遅かったかのいずれかであったが、分子の切断（ｔＰＡＨ）型は、良好な回復を可能にした。ＰＡＨおよびＧＣＨ１の組み合わせにより、細胞は、これらの酵素を発現しない類似の細胞よりも低いレベルのチロシン（例えば、チロシンの不在下）で増殖することができる。
【０００４】
したがって、第１の態様では、本発明は、１つ以上の核酸ベクターを含むベクター系を提供し、核酸ベクター系は、
ａ）宿主細胞におけるフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の発現を可能にする第１の制御配列に作動可能に連結された、機能的Ｎ末端調節ドメインを欠くＰＡＨをコードする配列を含む、第１の核酸配列と、
ｂ）宿主細胞におけるＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）の発現を可能にする第２の制御配列に作動可能に連結された、ＧＣＨ１をコードする配列を含む、第２の核酸配列と、
ｃ）宿主細胞における目的の産物の発現を可能にする第３の制御配列に作動可能に連結された、産物をコードする１つ以上の配列を挿入するための複数のクローニング部位と、を含む。
【０００５】
関連する態様では、本発明はまた、１つ以上の核酸ベクターを含むベクター系を提供し、核酸ベクター系は、
ａ）宿主細胞におけるフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の発現を可能にする第１の制御配列に作動可能に連結された、機能的Ｎ末端調節ドメインを欠くＰＡＨをコー
ドする配列を含む、第１の核酸配列と、
ｂ）宿主細胞におけるＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）の発現を可能にする第２の制御配列に作動可能に連結された、ＧＣＨ１をコードする配列を含む、第２の核酸配列と、
ｃ）宿主細胞における目的の産物の発現を可能にする第３の制御配列に作動可能に連結された、産物をコードする配列を含む、第３の核酸配列と、を含む。
【０００６】
そのようなベクターは、宿主細胞に導入されてもよく、それらの細胞は、非形質転換細胞の効率的な増殖を可能にしないチロシン制限条件下で選択されたベクターを含有する。したがって、第２の態様では、本発明は、宿主細胞を提供し、宿主細胞は、
ａ）宿主細胞におけるフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の発現を可能にする第１の制御配列に作動可能に連結された、ＰＡＨをコードする配列を含む、第１の外因性核酸と、
ｂ）宿主細胞におけるＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）の発現を可能にする第２の制御配列に作動可能に連結された、ＧＣＨ１をコードする、第２の外因性核酸と、
ｃ）宿主細胞における目的の産物の発現を可能にする第３の制御配列に作動可能に連結された、産物をコードする第３の外因性核酸と、を含む。
【０００７】
一実施形態では、第１、第２、および第３の核酸分子は、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
【０００８】
一実施形態では、宿主細胞は、哺乳類細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【０００９】
本発明の様々な態様では、ＰＡＨにおける機能的Ｎ末端調節ドメインの欠如は、例えば、切断ＰＡＨを形成するための欠失に起因し得る。ヒトおよびＣＨＯＰＡＨアミノ酸配列に基づいて、これは典型的には、最初の約１１６個のアミノ酸の欠失である。
【００１０】
一実施形態では、ＰＡＨは、ＣＨＯＰＡＨまたはヒトＰＡＨである。
（【００１１】以降は省略されています）

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