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公開番号2025116054
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-08-07
出願番号2025086632,2023512424
出願日2025-05-23,2021-09-28
発明の名称アデノ随伴ウイルスの収量を増加させるための核酸構築物及びその構築方法
出願人康霖生物科技(杭州)有限公司
代理人弁理士法人秀和特許事務所
主分類C12N 15/866 20060101AFI20250731BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】アデノ随伴ウイルスの収量を増加させるための核酸構築物及びその構築方法を提供することを課題とする。
【解決手段】核酸構築物であって、アデノ随伴ウイルス(AAV)エレメント、及びIEタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、AAVエレメントは、Capタンパク質をコードするポリヌクレオチド、Repタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びAAVシスエレメントを含む、核酸構築物を提供する。また、構築方法であって、外来標的遺伝子を運ぶAAVエレメント及びIEタンパク質をコードするポリヌクレオチドをバキュロウイルスベクター骨格に組み込むことを含む、構築方法を提供する。得られた本発明の組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)は、空カプシド率が低く、同時に単一細胞及び培養物の単位体積あたりのrAAV収量を増加させ、生産コストを削減し、スケールアップが容易である。
【選択図】図5
特許請求の範囲【請求項１】
核酸構築物であって、
ＡＡＶエレメント、及びＩＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、
前記ＡＡＶエレメントがＣａｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＡＡＶシスエレメントを含み、
前記ＩＥタンパク質が、Ａｃｉｅ０１によってコードされることを特徴とする、
核酸構築物。
続きを表示（約 820 文字）【請求項２】
バキュロウイルス組換え相同領域をコードするポリヌクレオチドを更に含むことを特徴とする、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
前記バキュロウイルス組換え相同領域が、ｈｒ１、ｈｒ２、ｈｒ３、ｈｒ４又はｈｒ５のうちの１つ以上から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記核酸構築物がＩＥタンパク質遺伝子のプロモーターを更に含み、前記ＩＥタンパク質遺伝子のプロモーターがＧｐ６４、ｐＨ、ｐ６．９又はｐ１０のうちの１つ以上から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記核酸構築物がバキュロウイルスプロモーターを更に含み、前記バキュロウイルスプロモーターがバキュロウイルス組換え相同領域に結合されていることを特徴とする、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項６】
前記バキュロウイルスプロモーターがｐＨ、Ｇｐ６４、ｐ６．９又はｐ１０のうちの１つ以上であることを特徴とする、請求項５に記載の核酸構築物。
【請求項７】
前記ＡＡＶシスエレメントがＩＴＲ配列から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項８】
前記核酸構築物が外来標的遺伝子を更に含み、前記外来標的遺伝子がＡＡＶエレメントに埋め込まれていることを特徴とする、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項９】
前記核酸構築物の構造が、ＩＥ遺伝子発現カセット－Ｃａｐ遺伝子発現カセット－ＩＴＲ－外来標的遺伝子発現カセット－ＩＴＲ－Ｒｅｐ遺伝子発現カセットであることを特徴とする、請求項８に記載の核酸構築物。
【請求項１０】
前記核酸構築物のヌクレオチド配列が配列番号１であることを特徴とする、請求項１に記載の核酸構築物。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入ベクターの技術分野に関し、特にアデノ随伴ウイルスの収量を増加させるための核酸構築物及びその構築方法に関する。
続きを表示（約 1,800 文字）【背景技術】
【０００２】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、基礎研究や臨床遺伝子治療で広く使用されている遺伝子導入ベクターである。その安全性が高く、宿主細胞範囲が広く、免疫原性が低く、生体内で外来遺伝子を発現させる時間が長いなどの特徴から、ｒＡＡＶは最も有望な遺伝子導入ベクターの１つと見なされており、世界中の遺伝子治療及びワクチン研究で広く使用されている。近年、ますます多くの研究者が大規模な動物研究及びヒト臨床試験にｒＡＡＶを使用している。ＡＡＶゲノムは、ＩＴＲ配列、非構造タンパク質Ｒｅｐ、及び構造タンパク質Ｃａｐの３つのコアエレメントを含む。
【０００３】
昆虫バキュロウイルス系は、組換えタンパク質を産生するための一般的な手段であり、従来のトリプルプラスミド一過性トランスフェクション法と比較して、昆虫細胞は、培養密度が高く、無血清浮遊培養が可能であり、スケールアップが容易であるという利点を有し、また、バキュロウイルス感染細胞の産生方法はバッチ安定性がより高い。研究者は２００２年からｒＡＡＶの産生にそれを使用し始めたが、昆虫細胞では、Ｃａｐ、Ｒｅｐ、及びＡＡＶベクターゲノムＤＮＡの比率が理想的な比率に達するのが容易ではなく、ＡＡＶのパッケージング効率が高くないなどの様々な理由により、従来の方法でパッケージングされた組換えＡＡＶベクターは、空カプシド率が高い（１１％～３４％）（非特許文献１）。空カプシドＡＡＶと標的遺伝子を運ぶＡＡＶの物理的及び化学的特性が非常に類似しており、精製が非常に難しいため、空カプシドＡＡＶは臨床グレードのＡＡＶベクターの製造において除去しなければならない不純物である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
Ｂｅｎｓｋｅｙｅｔａｌ．２０１６
ＳｍｉｔｈＲＨ，ＬｅｖｙＪＲ，ＫｏｔｉｎＲＭ：Ａｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ－ＡＡＶｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓｙｓｔｅｍｃｏｕｐｌｅｄｗｉｔｈｏｎｅ－ｓｔｅｐａｆｆｉｎｉｔｙｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｙｉｅｌｄｓｈｉｇｈ－ｔｉｔｅｒｒＡＡＶｓｔｏｃｋｓｆｒｏｍｉｎｓｅｃｔｃｅｌｌｓ．ＭｏｌＴｈｅｒ２００９，１７（１１）：１８８８－１８９６．
【発明の概要】
【０００５】
上記の従来技術の欠点に鑑みて、本発明の目的は、従来技術の問題を解決するために、組換えアデノ随伴ウイルスの収量及び品質を向上させるための核酸構築物及びその構築方法を提供することである。
【０００６】
上記の目的及び他の関連する目的を達成するために、本発明の第１態様によって提供される核酸構築物は、ＡＡＶエレメント、ＩＥタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びバキュロウイルス組換え相同領域をコードするポリヌクレオチドを含み、ＡＡＶエレメントはＣａｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＡＡＶシスエレメントを含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ＩＥタンパク質は、Ａｃｉｅ０、Ａｃｉｅ０１、Ａｃｉｅ０２のうちの１つ以上の遺伝子によってコードされ、及び／又は、バキュロウイルス組換え相同領域は、ｈｒ１、ｈｒ２、ｈｒ３、ｈｒ４又はｈｒ５のうちの１つ以上から選択される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、核酸構築物は、ＩＥタンパク質遺伝子のプロモーターを更に含む。いくつかの実施形態では、ＩＥタンパク質遺伝子のプロモーターは、Ｇｐ６４、ｐＨ、ｐ６．９又はｐ１０のうちの１つ以上から選択される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、核酸構築物は、バキュロウイルスプロモーターを更に含む。いくつかの実施形態では、バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルス組換え相同領域に結合される。いくつかの実施形態では、バキュロウイルスプロモーターは、好ましくは、ｐＨ、Ｇｐ６４、ｐ６．９又はｐ１０のうちの１つ以上である。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶシスエレメントは、ＩＴＲ配列から選択される。
（【００１１】以降は省略されています）

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