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公開番号2025108504
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-07-23
出願番号2025063479,2021568525
出願日2025-04-08,2020-05-15
発明の名称プライマー認識が改良されたPhi29 DNAポリメラーゼ変異体
出願人4ベースバイオソシエダーリミターダ
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/54 20060101AFI20250715BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】野生型酵素と比較して、プライマー認識が改良されたPhi29 DNAポリメラーゼの変異体を提供する。
【解決手段】変異K64RまたはM97Kの一方または両方を含む、Phi29型DNAポリメラーゼが提供される。提供される変異体は、野生型Phi29 DNAポリメラーゼと比較して、より短いおよびより長いランダム合成DNAプライマーをより効率的に使用することができ、多重置換増幅反応においてより多くの増幅産物を生成する。
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【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
変異K64RまたはM97Kの一方または両方を含む、Phi29型DNAポリメラーゼ。
続きを表示（約 1,300 文字）【請求項２】
SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、またはSEQ ID NO: 4と少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、Phi29型DNAポリメラーゼ。
【請求項３】
テンプレートDNAを複製、増幅、または配列決定するための方法であって、該DNAを、少なくとも
（a）請求項1または2に記載のDNAポリメラーゼ、
（b）緩衝液、
（c）塩化マグネシウム、
（d）プライマー、および
（e）ヌクレオシド三リン酸
を含む反応混合物と接触させる段階を含む、前記方法。
【請求項４】
請求項3に記載の方法を実施するためのキットであって、（a）請求項1または2に記載のDNAポリメラーゼ、（b）緩衝液、および（c）塩化マグネシウムを含む、前記キット。
【請求項５】
請求項3に記載の方法を実施するためのキットであって、請求項1または2に記載のDNAポリメラーゼと、
（a）PrimPol酵素（例えば、TthPrimPol）、
（b）ランダムトリマー、
（c）ランダムテトラマー、
（d）ランダムペンタマー、
（e）ランダムヘプタマー、
（f）ランダムオクタマー、
（g）dNTP、
（h）反応緩衝液、
（i）上記要素のいずれかと一緒に使用するための緩衝液
のうちの1個または複数とを含む、前記キット。
【請求項６】
SEQ ID NO: 1と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％または99.5％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアミノ酸置換K64RおよびM97Kの一方または両方を含む、Phi29型DNAポリメラーゼ。
【請求項７】
SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、またはSEQ ID NO: 4の配列を有する、請求項6に記載のPhi29型DNAポリメラーゼ。
【請求項８】
アミノ酸置換K64RおよびM97Kの一方または両方に加えて、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1個以下のアミノ酸置換、付加または欠失を有する、請求項6に記載のPhi29型DNAポリメラーゼ。
【請求項９】
Phi29型DNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子であって、該Phi29型DNAポリメラーゼが、SEQ ID NO: 1と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または99.5％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ該Phi29型DNAポリメラーゼが、アミノ酸置換K64RおよびM97Kの一方または両方を含む、前記単離された核酸分子。
【請求項１０】
前記Phi29型DNAポリメラーゼが、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、またはSEQ ID NO: 4の配列を有する、請求項9に記載の単離された核酸分子。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願への参照
本出願は、2019年5月17日に出願された米国仮出願第62/849,252号の優先日の恩典を主張するものであり、その内容は全体として本明細書に組み入れられる。
続きを表示（約 5,500 文字）【０００２】
配列表
本出願には、コンピュータ可読形式の配列表が含まれており、これは参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
背景
Phi29 DNAポリメラーゼ（Phi29 DNApol）は、線状dsDNA分子の両端でのタンパク質プライミングの開始（protein-primed initiation）と、各DNA鎖の完全伸長との両方を触媒することによってバクテリオファージゲノム（19285bp）の複製を担当する、単量体酵素（66kDa）である（Blanco and Salas, 1984; 1985）。Phi29 DNApolは、DNAポリメラーゼのファミリーBに属し（Bernad et al, 1987）、パーム（palm）、サム（thumb）、フィンガー（finger）のサブドメインを含むだけでなく、さらにTPR1とTPR2と呼ばれる2個の追加ドメインをも含む、一般的な右手フォールド（right-hand fold）を示す（Rodriguez et al, 2005; Kamtekar et al, 2006; Berman et al, 2007）。Phi29 DNApolは、数多くのDNA増幅・DNA配列決定の技術およびプラットフォームでのその応用を可能にするユニークな特性を示す：プロセシビティ因子（processivity factor）の非存在下で、該酵素がDNA結合イベントごとに70000超のヌクレオチドを組み込むことを可能にする、高度なプロセッシブDNA合成（Blanco et al, 1989）；ヘリカーゼ型酵素の非存在下で、二本鎖DNAの巻き戻しに連動した重合を可能にする、極めて優れた鎖置換（strand-displacement）（Blanco et al, 1989）；非常に低いエラー挿入率（10
-4
～10
-6
）と、挿入されたエラーの効率的な校正により、合わせて、組み込まれた10
6
～10
8
ヌクレオチドで最大1個のエラーにまで忠実度が向上する、高い合成の忠実度（Esteban et al, 1993 and 1994）。
【０００４】
これらの特性により，Phi29 DNApolは、等温の多重置換増幅（multiple displacement amplification：MDA）（Dean et al, 2002）およびローリングサークル増幅（rolling circle amplification：RCA）（Lizardi et al, 1998）にとって最適な選択肢となる。これらのDNA増幅技術は、Phi29 DNApolと、主にヘキサヌクレオチドつまりヘキサマーであるランダム合成プライマー（RP）、または増幅反応中にその場でDNAプライマーを合成できるDNAプライマーゼのいずれかと、の組み合わせに基づいている（Picher et al, 2016）。
【０００５】
現在の配列決定技術では、特定のサンプル（例えば、単一細胞）から得られるDNAの量が配列決定プロセスに十分ではないため、DNAの増幅が頻繁に必要となる。残念ながら、DNAの増幅には、エラーを導入したり、非対称（バイアス）を発生したり、さらには微量レベルの汚染DNAの同時増幅を促進したりするリスクがある。それゆえに、増幅の品質を決める重要なパラメータは、反応産物中の汚染物とアーティファクトの非存在、カバレッジ（coverage）の広がりと均一性、低いヌクレオチドエラー率、ならびに一塩基バリアント（SNV）、コピー数バリアント（CNV）および構造バリアントを正常な状態に戻す能力である。
【０００６】
ランダムヘキサマーに基づく現在のMDA法における潜在的な増幅バイアスの原因は、該オリゴヌクレオチドの配列依存的ハイブリダイゼーションの速度が異なることから生じるプライミングの不均等である。さらに重要なのは、自己ペアリング（self-pairing）するヘキサマーの指数関数的増幅によって引き起こされる、プライマー由来のインプット非依存性のDNA増幅アーティファクトを生成する傾向があることである。
【０００７】
ヘキサマーの代わりにより長いプライマーを使用して、反応温度を40℃にすると、DNA増幅のアーティファクトが大幅に減少することが示されている（Alsmadi et al, 2009）。この挙動の背後にある最も可能性の高い理由は、温度がより高いと、プライマーの安定した自己ペアリングの可能性が減り、そのためにそれらの後続の増幅が減少することである。しかしながら、40℃という高い温度（Phi29 DNApolの最適温度より10℃高い）で増幅反応を行うためには、熱安定性または熱抵抗性のPhi29 DNApolバリアントが必要である。これに関連して、いくつかの変異型Phi29 DNApolは、改良された熱安定性を示すことが記載されている（Povilaitis et al, 2016）。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
本明細書に組み入れられ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、例示的な態様を示すものであり、説明と一緒に、関連分野の当業者がこれらの態様および当業者に明らかな他の態様を実施しかつ使用できるようになるのにさらに役立つ。以下の図面と併せて、本発明をより具体的に説明することにする。
DNAおよびdNTPと複合体を形成したPhi29 DNApolの3D構造（PDB id：2PYL）。サム（ダークグリーン）、TPR2（シアン）およびTPR1（イエロー）のサブドメインを除いて、このタンパク質の大部分は白で示される。N末端の3'-5'エキソヌクレアーゼドメインは完全には描かれていない（2個のセグメントのみが示され（イエロー）、1つはArg
96
を含み、もう1つはLys
64
を含む）。プライマー鎖（シアン）については、各ヌクレオチド位置に対応する番号が示されている。テンプレート鎖（ライトグリーン）と、入ってくるヌクレオチド（マゼンタ）と、2個の活性化金属イオン（ベージュ）も示されている。
A）結晶構造（PDB id: 2PYL）から誘導された、プライマー鎖の最初の10ヌクレオチドとの相互作用に関与する野生型（WT）Phi29 DNApolアミノ酸残基の模式図。1の番号をつけたヌクレオチドは最も3'末端にあり、しばしば「プライマー末端」と呼ばれており、酵素活性部位に最も近いものである。B）この図は、（マゼンタで）示される様々な変異によって生じた、プライマー鎖との新しい相互作用の獲得を示している。色のついた矢印は、ホスホジエステル（レッド）、糖（オレンジ）、または塩基（グリーン）のいずれが相互作用に関わるかを示している。変異体T499KおよびT499Rは、相補鎖/テンプレート鎖の同じ位置（破線の矢印で示される）と相互作用することが予測される。
増幅反応へのインプットとして1ngのヒトゲノムDNAを使用する場合の、TthPrimPolまたは長さの異なるランダムプライマー（トリマー（3N）、テトラマー（4N）、ペンタマー（5N）、ヘキサマー（6N）、ヘプタマー（7N）またはオクタマー（8N））と組み合わせた、WT Phi29 DNApolまたは設計された変異体の増幅効率。
図3-1の続きの図である。
図3-2の続きの図である。
提供されたデオキシヌクレオチド（dNTP）濃度の関数としての、WT Phi29 DNApol、変異体K64R、変異体M97K、および二重変異体K64R/M97Kのエキソヌクレアーゼ活性とポリメラーゼ活性のバランス。
増幅反応へのインプットとして1ngのヒトゲノムDNAを使用する場合の、長さの異なるランダムプライマー（トリマー（3N）、テトラマー（4N）、ペンタマー（5N）、ヘキサマー（6N）、ヘプタマー（7N）またはオクタマー（8N））と組み合わせた、WT Phi29 DNApol、変異体K64R、変異体M97Kおよび二重変異体K64R/M97Kの増幅効率。各プライマーの長さNごとに、縦棒は、左から右に次の順序で示される：WT Phi29 DNApol、変異体K64R、変異体M97K、二重変異体K64R/M97K。
低イオン強度条件下で、サイズの異なるランダム合成プライマー（トリマー（3N）、テトラマー（4N）、ペンタマー（5N）、ヘキサマー（6N）、ヘプタマー（7N）またはオクタマー（8N））と組み合わせた、WT Phi29 DNApol、変異体K64R、変異体M97Kまたは二重変異体K64R/M97Kのいずれかを用いて、インプットDNAの非存在下で観察された増幅収量。各プライマーの長さNごとに、縦棒は、左から右に次の順序で示される：WT Phi29 DNApol、変異体K64R、変異体M97K、二重変異体K64R/M97K。
高イオン強度条件下で、サイズの異なるランダム合成プライマー（トリマー（3N）、テトラマー（4N）、ペンタマー（5N）、ヘキサマー（6N）、ヘプタマー（7N）またはオクタマー（8N））と組み合わせた、WT Phi29 DNApol、変異体K64R、変異体M97Kまたは二重変異体K64R/M97Kのいずれかを用いて、インプットDNAの非存在下で観察された増幅収量。各プライマーの長さNごとに、縦棒は、左から右に次の順序で示される：WT Phi29 DNApol、変異体K64R、変異体M97K、二重変異体K64R/M97K。
高イオン強度条件下で、増幅反応へのインプットとして1ngのヒトゲノムDNAを使用する場合の、長さの異なるランダム合成プライマー（トリマー（3N）、テトラマー（4N）、ペンタマー（5N）、ヘキサマー（6N）、ヘプタマー（7N）またはオクタマー（8N））と組み合わせた、WT Phi29 DNApol、変異体K64R、変異体M97Kおよび二重変異体K64R/M97Kの増幅効率。各プライマーの長さNごとに、縦棒は、左から右に次の順序で示される：WT Phi29 DNApol、変異体K64R、変異体M97K、二重変異体K64R/M97K。
低イオン強度および高イオン強度の条件下で、増幅反応において異なるヒトゲノムDNAインプット量（1、10、100pgおよび1ng）を使用する場合の、長さの異なるランダム合成プライマー（テトラマー（4N）、ペンタマー（5N）、ヘキサマー（6N））と組み合わせた、WT Phi29 DNApol、変異体K64R、変異体M97Kおよび二重変異体K64R/M97Kの増幅効率。各プライマーの長さNごとに、縦棒は、左から右に次の順序で示される：WT Phi29 DNApol、変異体K64R、変異体M97K、二重変異体K64R/M97K。
図9-1の続きの図である。
図9-2の続きの図である。
Phi29 DNApolバリアントとTthPrimPolを組み合わせた多重置換増幅（MDA）による1、10、100pgおよび1ngのヒトゲノムDNAの増幅。各DNA量ごとに、縦棒は、左から右に次の順序で示される：WT Phi29 DNApol、変異体K64R、変異体M97K、二重変異体K64R/M97K。
カバレッジの違いが観察され得る条件に達するために、各場合にPhi29 DNApolバリアントおよび異なるヒトゲノムDNAインプット量と組み合わせて、ヘキサマー（6N）、ペンタマー（5N）およびテトラマー（4N）を用いた増幅反応のCovCheck解析から得られた推定カバレッジ値。
図11-1の続きの図である。
TthPrimPolとPhi29 DNApolバリアントとを組み合わせて実施した増幅反応のCovCheck解析から得られた推定カバレッジ値。
【発明の概要】
【０００９】
概要
改変型DNAポリメラーゼは、DNA配列決定、DNA増幅、ライブラリー調製、DNAジェノタイピングなど、様々な用途に有用であり得る。本発明は、これらの用途または他の用途に特に望ましい、改良された特性を与える変異を含む組換え型のPhi29 DNAポリメラーゼを提供する。こうしたアミノ酸配列の変化は、より短いランダム合成プライマーを使用することによって多重置換DNA増幅（MDA）の性能を向上させることができ、その結果、増幅アーティファクトが減少し、配列依存性ハイブリダイゼーションの速度が向上し、それゆえに、改良されたカバレッジの広がりと均一性が得られる。「Phi29」は「φ29」と書かれることもある。
【００１０】
組換えPhi29 DNAポリメラーゼは、K64RおよびM97Kからなる群より選択される1個または2個の変異を含む。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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