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公開番号2025106514
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-07-15
出願番号2025065562,2021559829
出願日2025-04-11,2020-04-10
発明の名称脳内への特異性が増強されたウイルス組成物
出願人カリフォルニアインスティテュートオブテクノロジー
代理人個人,個人
主分類C12N 7/01 20060101AFI20250708BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】脳内への特異性が増強されたウイルス組成物の提供。
【解決手段】例えば脳および肝臓の標的細胞型におけるウイルス形質導入の特異性の増加および効率の向上を示す指向性を有する、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)を含む組成物およびキットが提供される。多重化されたCre組換えに基づくAAV標的進化(M-CREATE)法を使用してrAAVを発見する方法、およびrAAV媒介導入遺伝子療法により様々な疾患および状態を処置する方法を含むが、これらに限定されない、rAAVの治療および生物医学研究への応用も記載される。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
ｉ．配列番号１のアミノ酸２１７～アミノ酸７３６と少なくとも９８％同一である第１のアミノ酸配列
であって、前記第１のアミノ酸配列のアミノ酸２１７～アミノ酸５８６およびアミノ酸５９１～アミノ酸７３６が、配列番号１のアミノ酸２１７～アミノ酸５８６およびアミノ酸５９１～アミノ酸７３６と同一であり、配列番号１に対する位置５８７～５８８および位置５８９～５９０のアミノ酸残基がともにＡＱである、第１のアミノ酸配列
と、
ｉｉ．配列番号１内のアミノ酸５８８＿５８９位に挿入された、配列番号４３５～８５９、８６４、８６６からなる群より選択される第２のアミノ酸配列と
を含むＡＡＶカプシドタンパク質であって、対象に全身送達されたときに前記対象の中枢神経系（ＣＮＳ）において測定されたとき、配列番号１で提供される天然ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して特異性の増加および形質導入効率の向上のうちの少なくとも一方を特徴とし、配列番号１内の前記アミノ酸５８８＿５８９位における前記第２のアミノ酸配列が、ＴＬＡＶＰＦＫでも、ＫＦＰＶＡＬＴでも、ＳＶＳＫＰＦＦでも、ＦＴＦＴＴＰＫでも、ＭＮＡＴＫＮＶでも、ＮＧＧＴＳＳＳでも、ＴＲＴＮＰＥＡでも、ＹＴＦＳＱＧＷでもない、ＡＡＶカプシドタンパク質
を含む、ＡＡＶ。
続きを表示（約 700 文字）【請求項２】
前記第２のアミノ酸配列が、ＴＡＬＫＰＦＬ、ＴＴＬＫＰＦＬ、ＴＬＱＩＰＦＫ、ＴＭＱＫＰＦＩ、ＳＩＥＲＰＦＫ、
および
ＲＹＱＧＤＳ
Ｖか
らなる群から選択される、請求項１に記載のＡＡＶ。
【請求項３】
前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶカプシドを形成するＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質モノマー中に存在する、請求項１に記載のＡＡＶ。
【請求項４】
前記ＡＡＶカプシドがキメラである、請求項３に記載のＡＡＶ。
【請求項５】
前記ＡＡＶカプシドタンパク質の６０コピーがアセンブルされてＡＡＶカプシドになる、請求項３に記載のＡＡＶ。
【請求項６】
前記ＣＮＳが、ニューロン、乏突起膠細胞、星状膠細胞、および脳血管細胞からなる群から選択される細胞型を含む、請求項１に記載のＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ。
【請求項７】
前記ＣＮＳが、脳、視床、皮質、線条体、腹側中脳、および脊髄からなる群から選択される組織を含む、請求項１に記載のＡＡＶ。
【請求項８】
単離され、精製される、請求項１に記載のＡＡＶ。
【請求項９】
前記ＣＮＳの疾患または状態を処置するための静脈内投与用の医薬製剤として製剤化され、前記医薬製剤が、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１に記載のＡＡＶ。
【請求項１０】
前記医薬製剤が、治療剤をさらに含む、請求項
９
に記載のＡＡＶ。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１９年４月１１日に出願した米国特許仮出願第６２／８３２，８３６号の利益および優先権を主張するものであり、この仮出願の内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
続きを表示（約 5,300 文字）【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられたＮＳ０８７９４９、ＭＨ１１７０６９およびＯＤ０２５５３５のもとで政府の支援を受けてなされたものである。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、分裂細胞と非分裂細胞の両方に形質導入するそれらの能力、感染細胞内でのエピソームＤＮＡとしてのそれらの長期存続、およびそれらの低い免疫原性のため、基礎科学研究および治療への応用において遺伝子送達用のベクターとして広く使用されている。これらの特徴のため、ｒＡＡＶは、基礎科学への応用にも、遺伝子療法などの診療の場への応用にも、魅力的なものである。しかし、対象への全身送達時に、明確に異なる脳細胞型を特異的に標的とするように既存の血清型の性能を有意に向上させる必要がある。この必要性は、ＡＡＶが、中枢神経系（ＣＮＳ）に至るために血液脳関門（ＢＢＢ）を横断しなければならない場合、特に切実である。
【０００４】
既存のＡＡＶ血清型の全身送達は、ある特定の細胞型および器官に対する形質導入に限定されており、他の細胞型および器官では非特異的な重複する指向性を指し示す。これは、遺伝子療法への応用の際にいくつかの厄介な問題をもたらし、そのような問題には、影響を受けていない器官および細胞型（特に、肝臓）に対する形質導入に起因するオフターゲット効果、および目的の組織または器官において十分な治療レベルを達成するためのより大量のウイルス投薬量の必要性が、これらに限定されないが、含まれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ＣＮＳ内で測定されたときに特異性の増加および形質導入効率の上昇、ならびに一部の場合には、肝臓のような標的外環境では特異性の減少および形質導入効率の低下を有する指向性があるバリアントを生じさせる、反復的な正および負の選択ラウンドによって操作してカプシド構造に特異性を持たせたｒＡＡＶが、本明細書で開示される。本明細書に記載のｒＡＡＶは、全身送達（例えば、静脈内注射）時に対象における標的環境（例えば、標的細胞型または組織）への幅広い形質導入を達成する。
【０００６】
多重化されたＣｒｅ組換えに基づくＡＡＶ標的進化（Ｍ－ＣＲＥＡＴＥ）法を使用して本開示のｒＡＡＶを操作する方法も提供される。Ｍ－ＣＲＥＡＴＥ法は、（１）カプシドタンパク質配列への変異の導入、（２）定義された細胞集団に移動するバリアントのみのｉｎｖｉｖｏでの偏りのない選択および回収、（３）細胞膜の横断、（４）核への移動、ならびに（５）それらの遺伝子投薬量のパッケージングの解除および発現により、増強された形質導入効率および／または特異性を生じさせる。最も望ましい指向性（例えば、特定のｉｎｖｉｖｏ環境に対する増強された効率および特異性）を呈するバリアントカプシドが回収され、ディープシークエンシングにより同定される。偏りのない選択および解析のための戦略は、バリアントのエンリッチメントスコアを（標的組織ライブラリーを出発ウイルスライブラリーに対して正規化することにより）決定すること、および合成ライブラリー構築を通して選択ラウンド間の（各バリアントが等しく表される）偏りのない伝搬を判定することを含む。標的に対するバリアントの選択に関する有用な見識をもたらす、シークエンシングデータからの得られたライブラリーの詳細な特徴付けも、開示される。
【０００７】
Ｍ－ＣＲＥＡＴＥを使用して生成されたＡＡＶカプシドライブラリーが、本明細書で開示される。第１のライブラリー、ＡＡＶ９における７－ｍｅｒペプチド挿入（７－ｍｅｒ－ｉライブラリー）を、異なる脳細胞型－内皮細胞、ニューロンおよび星状膠細胞－にわたっての並行ｉｎｖｉｖｏ選択のために構築し、血液脳関門（ＢＢＢ）を標的とする能力はもちろん、それを横断し、中枢神経系（ＣＮＳ）に広く形質導入する能力も増強されたＡＡＶ９バリアントの大型プールを得た。第２のライブラリー、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂにおける３－ｍｅｒペプチド置換（３－ｍｅｒ－ｓライブラリー）を、ディープシークエンシングを組み込むことにより再調査して、カプシドを回収した。より大きな特異性でＣＮＳニューロンに形質導入するバリアントを含むＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂバリアントのプールを発見した。本開示のｒＡＡＶは、脳血液関門の内皮細胞、中枢神経系における異なる細胞型に広く形質導入することができるバリアント、およびニューロンへの形質導入に向けてより大きな特異性を呈することができるバリアントを効率的に標的とすることができる。
【０００８】
本明細書で開示される態様は、（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸２１７～アミノ酸７３６と少なくとも９８％同一である第１のアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号１内のアミノ酸５８８＿５８９位に挿入された表２～３または図３３で提供されるアミノ酸配列と少なくとも５７．１％同一の第２のアミノ酸配列とを含み、対象に全身送達されたときに対象の中枢神経系（ＣＮＳ）において測定されたとき、配列番号１で提供される天然ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して特異性の増加および形質導入効率の向上のうちの少なくとも一方を特徴とする、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む、ＡＡＶカプシドを提供する。一部の実施形態では、第２のアミノ酸配列は、表２～３または図３３で提供されるアミノ酸配列と少なくとも７１．４％同一である。一部の実施形態では、第２のアミノ酸配列は、表２～３または図３３で提供されるアミノ酸配列と少なくとも８６．７％同一である。一部の実施形態では、第２のアミノ酸配列は、ＴＡＬＫＰＦＬ、ＴＴＬＫＰＦＬ、ＴＬＱＩＰＦＫ、ＴＭＱＫＰＦＩ、ＳＩＥＲＰＦＫ、ＲＹＱＧＤＳＶ、およびＴＴＬＫＰＦＳからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３中に存在する。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、キメラである。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質の６０コピーがアセンブルされてＡＡＶカプシドになる。一部の実施形態では、ＣＮＳは、ニューロン、乏突起膠細胞、星状膠細胞、および脳血管細胞からなる群から選択される細胞型を含む。一部の実施形態では、ＣＮＳは、脳、視床、皮質、線条体、腹側中脳、および脊髄からなる群から選択される組織を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、アミノ酸置換Ａ５８７Ｄをさらに含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、アミノ酸置換Ｑ５８８Ｇをさらに含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ａ５８９Ｎを含むアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｑ５９０Ｐを含むアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、配列番号１内のアミノ酸５８８＿５８９位における第２のアミノ酸配列は、ＴＬＡＶＰＦＫでも、ＫＦＰＶＡＬＴでも、ＳＶＳＫＰＦＬでも、ＦＴＬＴＴＰＫでも、ＭＮＡＴＫＮＶでも、ＮＧＧＴＳＳＳでも、ＴＲＴＮＰＥＡでも、ＹＴＬＳＱＧＷでもない。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、単離され、精製される。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、肝臓の疾患または状態を処置するための静脈内投与用の医薬製剤として製剤化され、この医薬製剤は、薬学的に許容される担体をさらに含む。一部の実施形態では、医薬製剤は、治療剤をさらに含む。
【０００９】
本明細書で開示される態様は、配列番号１で提供されるＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸配列中のアミノ酸５８８とアミノ酸５８９の間に７アミノ酸挿入物（Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７）を含むＡＡＶカプシドタンパク質を含む、ＡＡＶカプシドであって、Ｘ１がＥ、Ｄ、Ｇ、Ｒ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸である、ＡＡＶカプシドを提供する。一部の実施形態では、Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸である。一部の実施形態では、Ｘ３は、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｔ、およびＱからなる群から選択されるアミノ酸である。一部の実施形態では、Ｘ４は、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸である。一部の実施形態では、Ｘ５は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｐ、Ｌ、Ｑ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸である。一部の実施形態では、Ｘ６は、Ｆ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸である。一部の実施形態では、Ｘ７は、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸である。一部の実施形態では、７アミノ酸挿入物は、ＴＡＬＫＰＦＬ、ＴＴＬＫＰＦＬ、ＴＬＱＩＰＦＫ、ＴＭＱＫＰＦＩ、ＳＩＥＲＰＦＫ、ＲＹＱＧＤＳＶ、およびＴＴＬＫＰＦＳからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３中に存在する。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、キメラである。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質の６０コピーがアセンブルされてＡＡＶカプシドになる。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、対象に全身送達されたときに対象の中枢神経系（ＣＮＳ）において測定されたとき、配列番号１で提供される天然ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して特異性の増加および形質導入効率の向上のうちの少なくとも一方を特徴とする。一部の実施形態では、ＣＮＳは、ニューロン、グリア細胞、乏突起膠細胞、上衣細胞、星状膠細胞、シュワン細胞、衛星細胞、および腸管グリア細胞からなる群から選択される細胞型を含む。一部の実施形態では、ＣＮＳは、脳、視床、皮質、線条体、腹側中脳、および脊髄からなる群から選択される組織を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ａ５８７Ｄを含むアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｑ５８８Ｇを含むアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ａ５８９Ｎを含むアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｑ５９０Ｐを含むアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、７アミノ酸挿入物は、ＴＬＡＶＰＦＫでも、ＫＦＰＶＡＬＴでも、ＳＶＳＫＰＦＬでも、ＦＴＬＴＴＰＫでも、ＭＮＡＴＫＮＶでも、ＮＧＧＴＳＳＳでも、ＴＲＴＮＰＥＡでも、ＹＴＬＳＱＧＷでもない。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、単離され、精製される。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、肝臓の疾患または状態を処置するための静脈内投与用の医薬製剤として製剤化され、この医薬製剤は、薬学的に許容される担体をさらに含む。一部の実施形態では、医薬製剤は、治療剤をさらに含む。
【００１０】
本明細書で提供される態様は、（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸２１７～アミノ酸７３６と少なくとも９８％同一である第１のアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号１内のアミノ酸５８８＿５８９位における表４または図３５で提供されるアミノ酸配列と少なくとも５７．１％同一の第２のアミノ酸配列とを含み、対象に全身送達されたときに対象の肝臓において測定されたとき、配列番号１で提供される天然ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して特異性の増加および形質導入効率の向上のうちの少なくとも一方を特徴とする、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む、ＡＡＶカプシドを提供する。一部の実施形態では、第２のアミノ酸配列は、表４または図３５で提供されるアミノ酸配列と少なくとも７１．４％同一である。一部の実施形態では、第２のアミノ酸配列は、表４または図３５で提供されるアミノ酸配列と少なくとも８６．７％同一である。一部の実施形態では、第２のアミノ酸配列は、ＫＡＹＳＶＱＶ、ＰＳＧＳＡＲＳ、およびＲＴＡＮＡＬＧからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３中に存在する。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、キメラである。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質の６０コピーがアセンブルされてＡＡＶカプシドになる。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、単離され、精製される。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、肝臓の疾患または状態を処置するための静脈内投与用の医薬製剤として製剤化され、この医薬製剤は、薬学的に許容される担体をさらに含む。一部の実施形態では、医薬製剤は、治療剤をさらに含む。
（【００１１】以降は省略されています）

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