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公開番号2025105575
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-07-10
出願番号2024230317
出願日2024-12-26
発明の名称β-(1,3)(1,4)-グルカン結合ポリペプチド、β-(1,3)(1,4)-グルカンの検出方法、β-(1,3)(1,4)-グルカン検出キット、および、β-1,3-グルカン結合ポリペプチド、β-1,3-グルカンの検出方法、β-1,3-グルカン検出キット、組換え微生物または細胞
出願人学校法人東京薬科大学
代理人個人
主分類C07K 14/435 20060101AFI20250703BHJP(有機化学)
要約【課題】13BGには結合せず、かつ、MLGに結合する性質を有するβ-(1,3)(1,4)-グルカン結合ポリペプチドを提供すること。
【解決手段】β-(1,3)(1,4)-グルカン結合ポリペプチドは、GH16型酵素に属する野生型β-(1,3)(1,4)-グルカナーゼの触媒ドメイン(CatD)を構成するポリペプチドのアミノ酸配列W1に含まれる以下の2種のモチーフ配列:配列番号44:EXDXE(Xは任意のアミノ酸を表す)または配列番号45:EXDXXE (Xは任意のアミノ酸を表す)において、それぞれの前記モチーフ配列における2つのグルタミン酸(E)のうちの少なくともいずれかが、他のアミノ酸に置換されており、かつ、前記アミノ酸配列W1と配列同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、β-(1,3)(1,4)-グルカン(MLG)との特異的結合活性を有する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
ＧＨ１６型酵素に属する野生型β－（１，３）（１，４）－グルカナーゼの触媒ドメイン（ＣａｔＤ）を構成するポリペプチドのアミノ酸配列Ｗ１に含まれる以下の２種のモチーフ配列：
配列番号４４：ＥＸＤＸＥ（Ｘは任意のアミノ酸を表す）、または
配列番号４５：ＥＸＤＸＸＥ（Ｘは任意のアミノ酸を表す）
において、それぞれの前記モチーフ配列における２つのグルタミン酸（Ｅ）のうちの少なくともいずれかが、他のアミノ酸に置換されており、かつ、前記アミノ酸配列Ｗ１と配列同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、
β－（１，３）（１，４）－グルカン（ＭＬＧ）との特異的結合活性を有する、
β－（１，３）（１，４）－グルカン結合ポリペプチド。
続きを表示（約 1,200 文字）【請求項２】
前記他のアミノ酸は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）のうちのいずれかである、
請求項１のβ－（１，３）（１，４）－グルカン結合ポリペプチド。
【請求項３】
前記アミノ酸配列Ｗ１が、配列番号２または配列番号６で表されるアミノ酸配列である、
請求項１のβ－（１，３）（１，４）－グルカン結合ポリペプチド。
【請求項４】
試験検体と、請求項１から３のいずれかのβ－（１，３）（１，４）－グルカン結合ポリペプチドを含む試薬とを接触させる工程を含む、
β－（１，３）（１，４）－グルカンの検出方法。
【請求項５】
請求項１から３のいずれかのβ－（１，３）（１，４）－グルカン結合ポリペプチドを含む試薬を有する、
β－（１，３）（１，４）－グルカン検出キット。
【請求項６】
請求項１から３のいずれかのβ－（１，３）（１，４）－グルカン結合ポリペプチドをコードする塩基配列を含む、組換え微生物または細胞。
【請求項７】
ＧＨ６４型酵素に属する野生型β－１,３－グルカナーゼの触媒ドメイン（ＣａｔＤ）を構成するポリペプチドのアミノ酸配列Ｗ２に含まれる以下のモチーフ配列：
配列番号４８：ＸＥＸＴＸ（Ｘは任意のアミノ酸を表す）
におけるグルタミン酸（Ｅ）が、他のアミノ酸に置換されており、かつ、前記アミノ酸配列Ｗ２と配列同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、
β－１,３－グルカン（１３ＢＧ）との特異的結合活性を有する、
β－１,３－グルカン結合ポリペプチド。
【請求項８】
ＧＨ８１型酵素に属する野生型β－１,３－グルカナーゼの触媒ドメイン（ＣａｔＤ）を構成するポリペプチドのアミノ酸配列Ｗ３に含まれる以下のモチーフ配列：
配列番号４９：ＥＳＸＳＥ（Ｘは任意のアミノ酸を表す）
における２つのグルタミン酸（Ｅ）のうちの少なくともＮ末端側に位置するグルタミン酸（Ｅ）が他のアミノ酸に置換されており、かつ、前記アミノ酸配列Ｗ３と配列同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、
β－１,３－グルカン（１３ＢＧ）との特異的結合活性を有する、
β－１,３－グルカン結合ポリペプチド。
【請求項９】
前記他のアミノ酸が、グルタミン（Ｑ）である、
請求項７または８のβ－１,３－グルカン結合ポリペプチド。
【請求項１０】
前記アミノ酸配列Ｗ２が、配列番号１７で表されるアミノ酸配列である、
請求項７のβ－１,３－グルカン結合ポリペプチド。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、β－（１，３）（１，４）－グルカン結合ポリペプチド、β－（１，３）（１，４）－グルカンの検出方法、β－（１，３）（１，４）－グルカン検出キット、および、組換え微生物または細胞に関する。また、本発明は、β－１,３－グルカン結合ポリペプチド、β－１,３－グルカンの検出方法、β－１,３－グルカン検出キット、組換え微生物または細胞に関する。
続きを表示（約 2,900 文字）【背景技術】
【０００２】
β－１,３－グルカン（以下、「１３ＢＧ」と記載する場合がある）は、β－グルカンのひとつとして知られ、グルコースがβ－１,３－結合により多数連結した繰り返し構造からなり、様々な真菌の細胞壁を構成する主要な多糖である。β－グルカンには、１３ＢＧを主鎖として、さらにグルコースがβ－１,６－結合あるいはβ－１,４－結合した分岐構造を持つものなども含まれる。また、他の多糖類やタンパク質などと複合体の形態を取ることもある。ヒトの体内で合成されないため、深在性の真菌感染症を疑う際には、血液中の１３ＢＧ濃度を測定することが常法とされる。特に、１３ＢＧはカンジダ属真菌やアスペルギルス属真菌などの菌体外放出多糖であることから、β－Ｄ－グルカン試験は真菌感染症を疑う患者の血液検査や、臓器移植後のリスク評価のための体内１３ＢＧのモニタリングなどに頻繁に利用される。
【０００３】
深在性の病原性真菌感染を診断するためのキットとして、いくつかの血中１３ＢＧの高感度検出試薬が利用されている。例えば、カブトガニの血球抽出物（Ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅｌｙｓａｔｅ）を用いたβ－Ｄ－グルカン試験、抗体を利用したＥＬＩＳＡキットなどが開発されている（例えば、特許文献１）。なかでも、カブトガニを原料とするβ－Ｄ－グルカン試験は多くの国で利用される血清診断薬であり、臨床現場での使用頻度が高い。
【０００４】
しかしながら、β－Ｄ－グルカン試験は主に植物などに由来するＭＬＧにも反応し、偽陽性を呈する例も少なくない。この課題は、Ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅｌｙｓａｔｅに含まれるセリンプロテアーゼ前駆体（ＦａｃｔｏｒＧ）の機能に起因する。ＦａｃｔｏｒＧは１３ＢＧに直接結合する機能を有するタンパク質であり、１３ＢＧとの結合により活性化し、プロテアーゼとして機能する。１３ＢＧ存在下、活性化ＦａｃｔｏｒＧは、さらにプロクロッティングエンザイムを活性化し、クロッティングエンザイムへと変換するが（非特許文献１）、このクロッティングエンザイムが切断可能な合成ペプチド基質などを用いることで、検体試料中の１３ＢＧ濃度を測定することが可能となる。
【０００５】
１３ＢＧによるＦａｃｔｏｒＧの活性化について、ＦａｃｔｏｒＧは、様々な１３ＢＧによって強く活性化すること、一方、ＣａｒｂｏｘｙｍｅｔｙｌＣｅｌｌｕｌｏｓｅ（β－１,４－グルカン誘導体）では活性化しないことが知られている（非特許文献２）。さらに、ＦａｃｔｏｒＧは、ＬｉｃｈｅｎａｎならびにＢａｒｌｅｙ β－グルカンなどのβ－（１，３）（１，４）－グルカン（以下、「ＭＬＧ」と記載する場合がある）によっても活性化することが知られている（非特許文献２）。ＭＬＧによるＦａｃｔｏｒＧの活性化は、臨床現場での偽陽性反応の原因のひとつと考えられている。また、同文献内では、水に溶解した一部の１３ＢＧ（Ｌａｍｉｎａｒａｎｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ、Ｐａｒｔｉａｌｌｙｄｅｇｒａｄｅｄｃｕｒｄｌａｎｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌａｎなど）との反応性が、他の１３ＢＧと比べて低くなることも示されており、これらは臨床現場での偽陰性反応にも関係する。
【０００６】
また、β－Ｄ－グルカン試験は、例えば、誤嚥時に気管支・肺へ移行した食品由来の１３ＢＧ、あるいは、穀物由来ＭＬＧによっても、陽性を示す例が存在する（非特許文献３）。通常、１３ＢＧなどの高分子多糖類は、消化管からの血中への移行はほとんど生じないと考えられているが、気管支・肺粘膜からは血中へ効率よく移行することが示されている（特許文献２）。そのため、ＦａｃｔｏｒＧが体内で増殖する病原性真菌由来の１３ＢＧ以外にも、植物由来のＭＬＧなどによっても活性化されるという性質をもつ以上、真菌症検査における偽陽性反応は一定数起こり得る問題であり、避けることが困難な課題と言える。
【０００７】
臨床診断で利用されるβ－Ｄ－グルカン試験はカブトガニを原料とするが、カブトガニとその卵は生態系において重要な位置付けにあり、多くの生物の栄養源となっているため、関連する海洋資源の減少や枯渇が懸念されている（非特許文献４）。海洋資源への影響を回避するために、β－Ｄ－グルカン試験に必要なタンパク質をリコンビナントタンパク質として調整する方法も開発されている（特許文献３）。しかしながら、最終的な反応性はＦａｃｔｏｒＧの多糖認識機能に依存するため、リコンビナントタンパク質を用いて作成されたβ－Ｄ－グルカン試験も、１３ＢＧ以外のＭＬＧなどの多糖によってもＦａｃｔｏｒＧの活性化が誘導されることは容易に予想される。さらに、上述した通り、分岐構造や分子量の異なる１３ＢＧに対して異なる反応性を示す点も、カブトガニを原料とするβ－Ｄ－グルカン試験において課題となる。そのため、ＦａｃｔｏｒＧの多糖認識機能に依存しない方法による血中１３ＢＧ濃度の測定法は有用であると言える。
【０００８】
１３ＢＧを検出・定量するにあたり、ＦａｃｔｏｒＧ以外の１３ＢＧ結合タンパク質を利用した方法が複数開発されている。例えば、抗１３ＢＧ抗体を用いた方法（特許文献１、特許文献４、非特許文献５）、哺乳類の１３ＢＧ受容体であるＤｅｃｔｉｎ－１の細胞外ドメインのリコンビナントタンパク質を用いた方法（非特許文献６）、カイコなどの昆虫がもつβ－グルカン認識タンパク質（ＢＧＲＰ）の１３ＢＧ結合ドメインのリコンビナントタンパク質を用いる方法などが開発されている（特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
国際公開ＷＯ２０２０／０２２４６７
国際公開ＷＯ２００７／０６９６８９
特許第７３５８５０９号
特開２００８－２７３９１７号公報
特許第６９６６７５６号
【非特許文献】
【００１０】
Morita T, et al, FEBS Lett 129:318-321 (1981)
Tanaka S, et al, Carbohydr Res 218:167-174 (1991)
Yamamoto T, et al, Intern Med 61:2935-2939 (2022)
Maloney T, et al, PLoS Biol 16:e2006607 (2018)
Milton D, et al, Appl Environ Microbiol67:5420-5424 (2001)
Graham L, et al, J Immunol Methods 314:164-169 (2006)
Yamanaka D, et al, Int J Mol Sci 22:1576 (2021)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
（【００１１】以降は省略されています）

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