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公開番号2025101683
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-07-07
出願番号2023218699
出願日2023-12-25
発明の名称高効率な酵母遺伝子系
出願人国立大学法人神戸大学
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/12 20060101AFI20250630BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】本開示は、IRESを用いた遺伝子発現を提供する。
【解決手段】本開示は、Internal Ribosome Entry Site(IRES)活性を促進するための組成物であって、前記組成物はRPS25ポリペプチドまたはその改変体を含む組成物を提供する。本開示はまた、テトラヒドロ葉酸(THF)/葉酸代謝の関連遺伝子またはその活性を調節する因子を含む、Internal Ribosome Entry Site(IRES)活性を促進するための組成物を提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
ＩｎｔｅｒｎａｌＲｉｂｏｓｏｍｅＥｎｔｒｙＳｉｔｅ（ＩＲＥＳ）活性を促進するための組成物であって、前記組成物はＲＰＳ２５ポリペプチドまたはその改変体を含む組成物。
続きを表示（約 1,000 文字）【請求項２】
前記ＲＰＳ２５ポリペプチドは、４０ＳｒｉｂｏｓｏｍｅのｅＳ２５サブユニットであって、ＩＲＥＳと直接相互作用するものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＲＰＳ２５ポリペプチドは、
１）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であり、かつ、
２）塩基性で構造を持たないＮ末端ドメインと、球状のヘッドドメインと、ヘッドドメインの溝に向かって折り畳まれたＣ末端ドメインと、で構成される、
請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
細胞におけるＩｎｔｅｒｎａｌＲｉｂｏｓｏｍｅＥｎｔｒｙＳｉｔｅ（ＩＲＥＳ）活性を促進するための組成物であって、前記組成物は該細胞のＲＰＳ２５ポリペプチドの改変体、または該細胞のものとは異なる種のＲＰＳ２５ポリペプチドもしくはその改変体、あるいはこれらをコードする核酸分子を含む組成物。
【請求項５】
前記細胞は酵母である、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記細胞は酵母であり、前記異なる種は、ヒアリまたはヒトである、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
ＲＰＳ２５ポリペプチドもしくはその改変体、あるいはこれをコードする核酸が導入されまたは改変された、ＩｎｔｅｒｎａｌＲｉｂｏｓｏｍｅＥｎｔｒｙＳｉｔｅ（ＩＲＥＳ）活性が促進された微生物。
【請求項８】
前記ＲＰＳ２５ポリペプチドは、４０ＳｒｉｂｏｓｏｍｅのｅＳ２５サブユニットであって、ＩＲＥＳと直接相互作用するものである、請求項７に記載の微生物。
【請求項９】
前記ＲＰＳ２５ポリペプチドは、
１）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であり、かつ、
２）塩基性で構造を持たないＮ末端ドメインと、球状のヘッドドメインと、ヘッドドメインの溝に向かって折り畳まれたＣ末端ドメインと、で構成される、
請求項７に記載の微生物。
【請求項１０】
細胞におけるＩｎｔｅｒｎａｌＲｉｂｏｓｏｍｅＥｎｔｒｙＳｉｔｅ（ＩＲＥＳ）活性を促進する微生物であって、前記微生物は該微生物のＲＰＳ２５ポリペプチドの改変体、または該細胞のものとは異なる種のＲＰＳ２５ポリペプチドもしくはその改変体、あるいはこれをコードする核酸を含む微生物。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本開示は高効率な遺伝子発現系に関する。
続きを表示（約 6,900 文字）【背景技術】
【０００２】
分子生物学・合成生物学などの目覚しい発展により、生物学者が一度に扱う遺伝子の数が飛躍的に増えてきた。特に遺伝子工学が容易な大腸菌のような原核生物では、数十の遺伝子からなる生命機能を作りあげる研究も報告されている。これは、1) 遺伝子を制御するDNA配列（プロモータやターミネータ）が短いことと、2) 多数の遺伝子を単純に並べるだけの「オペロン型」の遺伝子発現が可能なことによって実現されている。一方で、真核生物ではオペロン型の遺伝子発現が起こらないため、遺伝子ひとつずつにプロモータやターミネータを配置する必要があり、さらにそれぞれが原核生物に比べて長い。多数の遺伝子からなる生命システムを一から再構成することは不可能であった。
【０００３】
真核生物でもＩｎｔｅｒｎａｌｒｉｂｏｓｏｍａｌｅｎｔｒｙｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）と呼ばれるＤＮＡ配列を用いればオペロン型の遺伝子発現がわずかに起こるものの、その発現量が小さすぎるために、原核生物のオペロンと同じように扱うことは不可能であった。非特許文献１は、メチオニンｔＲＮＡをコードするＩＭＴ３およびＩＭＴ４の機能を欠失した酵母において、ＩＲＥＳの機能により翻訳されるＵＲＡ３タンパク質の機能が回復することを示している。非特許文献２は、酵母内在のＲＰＳ２５タンパク質について、アラニンへの置換によりＩＲＥＳ機能を最大で２倍程度促進することを示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
Thompson SR, Gulyas KD, Sarnow P. Internal initiation in Saccharomyces cerevisiae mediated by an initiator tRNA/eIF2-independent internal ribosome entry site element. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Nov 6;98(23):12972-7. doi: 10.1073/pnas.241286698. Epub 2001 Oct 30. PMID: 11687653; PMCID: PMC60809.
Walters B, Axhemi A, Jankowsky E, Thompson SR. Binding of a viral IRES to the 40S subunit occurs in two successive steps mediated by eS25. Nucleic Acids Res. 2020 Aug 20;48(14):8063-8073. doi: 10.1093/nar/gkaa547. PMID: 32609821; PMCID: PMC7430650.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、ＩＲＥＳを用いた遺伝子発現を提供する。本開示は特に，主に哺乳細胞においてしばしば用いられてきた技術において，その活性を飛躍的に高めた技術を提供する。
従って、本開示は、例えば、以下を提供する。
［項目１］ＩｎｔｅｒｎａｌＲｉｂｏｓｏｍｅＥｎｔｒｙＳｉｔｅ（ＩＲＥＳ）活性を促進するための組成物であって、前記組成物はＲＰＳ２５ポリペプチドまたはその改変体を含む組成物。
［項目２］前記ＲＰＳ２５ポリペプチドは、４０ＳｒｉｂｏｓｏｍｅのｅＳ２５サブユニットであって、ＩＲＥＳと直接相互作用するものである、上記項目に記載の組成物。
［項目２Ａ］前記ＲＰＳ２５ポリペプチドは、１）ＩＲＥＳを介した遺伝子の翻訳、２）リボソームシャンティング、３）ＲＡＮ（Ｒｅｐｅａｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｎｏｎ－ＡＵＧ）翻訳からなる群より選択される少なくとも１つの機能をさらに含む、上記項目の少なくとも１つに記載の組成物。
［項目３］前記ＲＰＳ２５ポリペプチドは、
１）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であり、かつ、
２）塩基性で構造を持たないＮ末端ドメインと、球状のヘッドドメインと、ヘッドドメインの溝に向かって折り畳まれたＣ末端ドメインと、で構成される、上記項目の少なくとも１つに記載の組成物。
［項目４］細胞におけるＩｎｔｅｒｎａｌＲｉｂｏｓｏｍｅＥｎｔｒｙＳｉｔｅ（ＩＲＥＳ）活性を促進するための組成物であって、前記組成物は該細胞のＲＰＳ２５ポリペプチドの改変体、または該細胞のものとは異なる種のＲＰＳ２５ポリペプチドもしくはその改変体、あるいはこれらをコードする核酸分子を含む組成物。
［項目５］前記細胞は酵母である、上記項目の少なくとも１つに記載の組成物。
［項目６］前記細胞は酵母であり、前記異なる種は、ヒアリまたはヒトである、上記項目の少なくとも１つに記載の組成物。
［項目７］ＲＰＳ２５ポリペプチドもしくはその改変体、あるいはこれをコードする核酸が導入されまたは改変された、ＩｎｔｅｒｎａｌＲｉｂｏｓｏｍｅＥｎｔｒｙＳｉｔｅ（ＩＲＥＳ）活性が促進された微生物。
［項目８］前記ＲＰＳ２５ポリペプチドは、４０ＳｒｉｂｏｓｏｍｅのｅＳ２５サブユニットであって、ＩＲＥＳと直接相互作用するものである、上記項目の少なくとも１つに記載の微生物。
［項目９］前記ＲＰＳ２５ポリペプチドは、
１）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であり、かつ、
２）塩基性で構造を持たないＮ末端ドメインと、球状のヘッドドメインと、ヘッドドメインの溝に向かって折り畳まれたＣ末端ドメインと、で構成される、
上記項目の少なくとも１つに記載の微生物。
［項目１０］細胞におけるＩｎｔｅｒｎａｌＲｉｂｏｓｏｍｅＥｎｔｒｙＳｉｔｅ（ＩＲＥＳ）活性を促進する微生物であって、前記微生物は該微生物のＲＰＳ２５ポリペプチドの改変体、または該細胞のものとは異なる種のＲＰＳ２５ポリペプチドもしくはその改変体、あるいはこれをコードする核酸を含む微生物。
［項目１１］前記微生物は酵母、ヒトやＣｈｉｎｅｓｅＨａｍｓｔｅｒＯｖａｒｙ、昆虫、または植物の培養細胞である、上記項目の少なくとも１つに記載の微生物。
［項目１２］前記微生物は酵母であり、前記異なる種は、ヒアリまたはヒトである、上記項目の少なくとも１つに記載の微生物。
［項目１３］前記微生物は酵母であり、前記微生物は前記微生物で機能しないＩＲＥＳを有し、前記異なる種は、ヒアリまたはヒトの種である、上記項目の少なくとも１つに記載の微生物。
［項目１４］ＩＲＥＳ活性調節部位が少なくとも1つ変異された、ＲＰＳ２５ポリペプチド。
［項目１４Ａ］前記調節は消失、抑制もしくは増加、またはそれらの組合せである、ＲＰＳポリペプチド。
［項目１５］前記ＲＰＳ２５ポリペプチドは、該ＲＰＳ２５ポリペプチドの野生型配列において、少なくとも、塩基性で構造を持たないＮ末端ドメイン、球状のヘッドドメイン、ヘッドドメインの溝に向かって折り畳まれたＣ末端ドメインからなる群より選択される少なくとも１つが少なくとも１アミノ酸が変異された、上記項目の少なくとも１つに記載のＲＰＳ２５ポリペプチド。
［項目１５Ａ］前記変異は、アミノ酸の変更、付加、もしくは欠失、またはそれらの組合せである、上記項目の少なくとも１つに記載のＲＰＳ２５ポリペプチド。
［項目１６］前記ＲＰＳ２５ポリペプチドは、
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列のフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が変異しており、該変異が、置換、付加および／もしくは欠失を含むポリペプチドであって、かつ、（ａ）のポリペプチドの生物学的活性と同種の生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１に示す塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子の相同遺伝子によってコードされる、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対するアミノ酸配列の同一性が少なくとも約７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、（ａ）のポリペプチドの生物学的活性と同種の生物学的活性を有する、ポリペプチドである、上記項目の少なくとも１つにに記載のＲＰＳ２５ポリペプチド。
［項目１７］前記ＩＲＥＳ活性促進部位は、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１～４７および１０６～１２５に相当する位置から選択される少なくとも1つのアミノ酸位を含む、上記項目の少なくとも１つに記載のＲＰＳ２５ポリペプチド。
［項目１８］前記ＩＲＥＳ活性促進部位は、配列番号２に示すアミノ酸配列においてアミノ酸位３４、４２、４４、および／または４８位に相当する位置から選択される、上記項目の少なくとも１つに記載のＲＰＳ２５ポリペプチド。
［項目１９］前記ＲＰＳ２５は、酵母由来のものまたは酵母以外の由来のものである、上記項目の少なくとも１つに記載のＲＰＳ２５ポリペプチド。
［項目２０］前記ＲＰＳ２５は、動物の由来のものである、上記項目の少なくとも１つに記載のＲＰＳ２５ポリペプチド。
［項目２１］天然型の配列において少なくとも１つのヌクレオチド変異を有し、対象となる微生物に挿入された際に、ＩＲＥＳ活性が促進される、ＲＰＳ２５ポリペプチド。
［項目２２］請求項１５～２０のいずれか一項に記載のＲＰＳ２５ポリペプチドをコードする、上記項目の少なくとも１つに記載の核酸分子。
［項目２３］前記ＲＰＳ２５をコードする核酸分子は、配列番号１もしくは３に示す核酸配列、または配列番号２または４に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列の配列改変体であって、該配列改変体は、
（１）配列番号１もしくは３に示す核酸配列、または配列番号２または４に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列において１以上の置換、付加および／もしくは欠失を有する配列改変体、
（２）配列番号１もしくは３に示す核酸配列、または配列番号２または４に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列に対して少なくとも約７０％でかつ１００％未満の配列同一性を有する配列改変体、
（３）配列番号１もしくは３に示す核酸配列、または配列番号２または４に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、配列番号１に示す核酸配列もしくは配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列とは異なる配列改変体、
（４）配列番号１もしくは３に示す核酸配列、または配列番号２または４に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列の対立遺伝子変異体において１以上の置換、付加および／もしくは欠失を有するである配列改変体、もしくは
（５）配列番号１もしくは３に示す核酸配列、または配列番号２または４に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列、または（１）～（４）のフラグメントである配列改変体であり、
該配列改変体がコードするタンパク質は、配列番号１もしくは３に示す核酸配列、または配列番号２または４に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列がコードするタンパク質の生物学的機能を有するものである、上記項目の少なくとも１つに記載のＲＰＳ２５核酸分子。
［項目２４］オートファジー・テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）／葉酸代謝［ＡＴＦＭ］の関連遺伝子またはその活性を調節する因子を含む、ＩｎｔｅｒｎａｌＲｉｂｏｓｏｍｅＥｎｔｒｙＳｉｔｅ（ＩＲＥＳ）活性を促進するための組成物。
［項目２５］前記オートファジー・テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）／葉酸代謝の関連遺伝子またはその活性を調節する因子は、ＭＥＴ１２、ＡＴＧ１、ＸＲＮ１、ＧＣＮ４、ＲＫＭ２、ＭＥＴ１３，ＭＥＴ６、ＡＤＥ８，ＡＤＥ１７、ＦＭＴ１、ＭＩＳ１、ＳＨＭ１、ＧＣＶ１、ＦＡＵ１、ＡＤＥ３、ＭＴＤ１、ＡＤＥ１６、およびＳＨＭ２からなる群より選択される、上記項目の少なくとも１つに記載の組成物。
［項目２６］前記オートファジー・テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）／葉酸代謝関連の遺伝子またはその活性を調節する因子は、前記テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）／葉酸代謝の関連遺伝子を含む、上記項目の少なくとも１つに記載の組成物。
［項目２７］前記オートファジー・テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）／葉酸代謝関連の遺伝子またはその活性を調節する因子は、オートファジー関連遺伝子またはその活性を調節する因子を含む、上記項目の少なくとも１つに記載の組成物。
［項目２８］前記テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）／葉酸代謝の関連遺伝子は、ＭＥＴ１２、ＭＥＴ１３，ＭＥＴ６、ＡＤＥ８，ＡＤＥ１７、ＦＭＴ１、ＭＩＳ１、ＳＨＭ１、ＧＣＶ１、ＦＡＵ１、ＡＤＥ３、ＭＴＤ１、ＡＤＥ１６、およびＳＨＭ２からなる群より選択される少なくとも１つを含む上記項目の少なくとも１つに記載の組成物。
［項目２９］前記テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）の代謝関連遺伝子は、ＭＥＴ１２、ＭＥＴ１３，ＡＤＥ８，およびＡＤＥ１７（活性が高めのもの）からなる群より選択されるものを含む、上記項目の少なくとも１つに記載の組成物。
【０００６】
本開示は、ＩＲＥＳを用いた遺伝子発現を提供する。本開示は特に、主に哺乳細胞においてしばしば用いられてきた技術において、その活性を飛躍的に高めた技術を提供する。ＩＲＥＳの配列を改変した報告はあるものの、活性が向上した例はない。特に、酵母におけるＩＲＥＳ活性がなぜ小さいのかは、これまで全く明らかになっていなかった。酵母にヒト由来のリボソームサブユニットのＲＰＳ５を発現させた場合に、または酵母のＲＰＳ２５に変異を加えた際にＩＲＥＳ活性がわずかに向上することが知られているものの、その効果は極めて限定的で、向上幅はせいぜい2倍程度であった。数十倍もの改良が実現されたのは本発明が初めてであり、これまでほとんど検出されていなかった、「ＩＲＥＳを使った遺伝子発現」を、酵母の一般的な遺伝子発現系（構成発現プロモータ）と同様レベルにまで高めることができた。特にヒトとヒアリのＲＰＳ２５遺伝子のキメラ化自体が本発明で初めて検討され、またその追加発現がＩＲＥＳ活性を大きく高めるという事実も本発明において初めて発見された。オートファジーおよび葉酸代謝（ＴＨＦ）とＩＲＥＳ機能との関係も本発明で初めて見出し、これらを「オートファジー・テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）／葉酸代謝の関連遺伝子またはその活性を調節する因子」という概念があることを見出した。このようにＩＲＥＳ活性の向上の関係で新たな因子群が存在することおよびこれを応用した例も初めてである。
【０００７】
本開示により、真核生物でも使えるオペロン型の遺伝子発現系が開発でき、多数の遺伝子からなる代謝経路や遺伝子制御ネットワークが容易に開発できるようになった。
【０００８】
本開示はまた、任意の分子に結合するＲＮＡアプタマーをＩＲＥＳに融合すると、標的の分子があるときにのみＩＲＥＳの活性がＯＮまたはＯＦＦになるバイオセンサを構築することが可能である。もしＩＲＥＳ活性の発現を高めることができれば、任意の分子（ＲＮＡやＤＮＡを含む）を検出するバイオセンサを自在に開発できるようになった。
【０００９】
本開示はさらに、ＩＲＥＳと「環状型ＲＮＡ」を利用した次世代型ＲＮＡワクチンにおいて利用され得る。このワクチンにおいて、ＩＲＥＳ活性は抗原タンパク質の発現に必須の要素であり、ＩＲＥＳ活性を高める因子が同定できたことにより、新規のＲＮＡワクチンの有効性を高めることができるようになった。
【００１０】
本開示は、以上のように、ＩＲＥＳからの遺伝子発現の分野で応用でき、さまざまな応用が可能になった。本開示の具体的な実施形態では、酵母内ＩＲＥＳ活性を高めることができ、酵母を対象にした生物工学全般の発展に寄与することができる。
（【００１１】以降は省略されています）

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