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公開番号2025096348
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-06-26
出願番号2025060987,2021534084
出願日2025-04-02,2020-07-22
発明の名称ウロリチン類の水酸基を脱水酸化する酵素
出願人株式会社ダイセル
代理人弁理士法人秀和特許事務所
主分類C12N 9/02 20060101AFI20250619BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】少なくとも、所定の位置に水酸基を有するウロリチン類の該位置の水酸基を脱水酸化する酵素を提供すること。
【解決手段】下記(1)及び(2)の性質を有する酵素:(1)ウロリチン類の4位の水酸基を脱水酸化する;(2)メチルビオロゲン(MV)存在下に、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)、フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)、及びフラビンアデニンモノヌクレオチド(FMN)から成る群から選択される一又はそれ以上で活性化される。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
続きを表示（約 940 文字）【請求項２】
配列番号２６で表される塩基配列を含む、又は配列番号２８で表される塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを発現可能に保持した、又は請求項３に記載のベクターを発現可能に保持した、形質転換体。
【請求項５】
請求項４に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項２に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質を製造する方法。
【請求項６】
下記工程（Ｉ）を含む、請求項４に記載の形質転換体の細胞外から細胞内へのエラグ酸の取り込みを促進する方法。
工程（Ｉ）：請求項４に記載の形質転換体をエラグ酸と接触させる工程。
【請求項７】
下記工程（Ｉ）を含む、ウロリチンＭ５の製造方法：
工程（Ｉ）：請求項４に記載の形質転換体であって、その宿主がエラグ酸からウロリチンＭ５を生成する能力を有する微生物である、形質転換体を、エラグ酸に接触させ、エラグ酸からウロリチンＭ５を生成する工程。
【請求項８】
下記工程（Ｉ）を含む、ウロリチンＣの製造方法：
工程（Ｉ）：請求項４に記載の形質転換体であって、その宿主がエラグ酸からウロリチンＣを生成する能力を有する微生物である、形質転換体を、エラグ酸に接触させ、エラグ酸からウロリチンＣを生成する工程。
【請求項９】
下記工程（Ｉ）及び（ＩＩ）を含む、ウロリチンＡの製造方法：
工程（Ｉ）：請求項４に記載の形質転換体であって、その宿主がエラグ酸からウロリチンＣを生成する能力を有する微生物である、形質転換体を、エラグ酸に接触させ、エラグ酸からウロリチンＣを生成する工程。
工程（ＩＩ）：ウロリチンＣからウロリチンＡを生成する能力を有する微生物に、前記ウロリチンＣからウロリチンＡを生成させる工程。
【請求項１０】
配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本開示は、ウロリチン類の水酸基を脱水酸化する酵素に関する。
続きを表示（約 4,100 文字）【背景技術】
【０００２】
ウロリチンＡやウロリチンＣに代表されるウロリチン類は、ザクロ、ラズベリー、ブラックベリー、クラウドベリー、イチゴ、クルミなどのベリー類等に含まれるエラジタンニン等に由来するエラグ酸の腸内代謝物として知られている。
【０００３】
これらのウロリチン類を合成する方法としては、２－ブロモ－５－メトキシ安息香酸を出発原料として脱メチル化によって２－ブロモ－５－ヒドロキシ安息香酸とし、レゾルシノールと反応させることによってウロリチンＡを得る方法などが報告されている（非特許文献１）。しかし、ウロリチン類を機能性食品（飲料、サプリメントを含む。）の素材として利用するには、このような化学合成法は適さない。
【０００４】
一方、エラジタンニンやエラグ酸は体内に摂取された後、腸内微生物叢によって代謝されてウロリチン類に変換されることが知られている。近年、ウロリチン類の一種であるウロリチンＣをエラグ酸から生成する腸内細菌としてゴルドニバクター・ウロリチンファシエンス（Gordonibacter urolithinfaciens）に属する微生物、ゴルドニバクター・パメラエアエ（Gordonibacter pamelaeae）に属する微生物が見出され、これらの腸内細菌を用
い、エラグ酸の発酵によりウロリチンＣを産生する方法が報告されている（特許文献１、非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
国際公開２０１４／１４７２８０号
【非特許文献】
【０００６】
J. Agric. Food Chem., 56, 393-400 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本開示の課題は、少なくとも、所定の位置に水酸基を有するウロリチン類の該位置の水酸基を脱水酸化する酵素を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ゴルドニバクター・ウロリチンファシエンス（Gordonibacter urolithinfaciens）の特定の菌株のプロテオーム解析により、エラグ酸を含まない培地で培養した場合よりもエラグ酸を含む培地で培養した場合の方が、発現量が顕著に大きいタンパク質が存在することを発見した。
更に、所定の菌株より４位に水酸基を有するウロリチン類の該４位の水酸基を脱水酸化する反応を触媒する酵素を精製し、プロテオーム解析を行った結果、得られた精製酵素が、エラグ酸を含む培地で培養した場合に発現量が顕著に増加したタンパク質の一部と一致することが分かり、該酵素をコードする遺伝子を異種の微生物に導入することにより、該酵素の発現に成功し、該遺伝子の機能を特定することができた。
また、該酵素をコードする遺伝子のゲノム周辺には、該遺伝子と相同性を有し、１０位に水酸基を有するウロリチン類の該１０位の水酸基を脱水酸化する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子をはじめ、エラグ酸のラクトンを加水分解しウロリチンＭ５を生成する
エラグ酸ラクトナーゼをコードする遺伝子、ウロリチントランスポーターをコードする遺伝子が存在することを見出した。
本開示は下記の態様を含む。
【０００９】
〔１〕下記（１）及び（２）の性質を有する酵素。
（１）ウロリチン類の４位の水酸基を脱水酸化する。
（２）メチルビオロゲン（ＭＶ）存在下に、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、及びフラビンアデニンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）から成る群から選択される一又はそれ以上で活性化される。
〔２〕下記（３）及び（４）の性質を有する、〔１〕に記載の酵素。
（３）至適ｐＨが５．５以上７．５以下である。
（４）SDS-PAGEの結果において、分子量として81,000以上99,000以下を示すバンドが含まれる。
〔３〕下記（５）の性質を有する、〔１〕又は〔２〕に記載の酵素。
（５）至適温度が３７℃以上５０℃以下である。
〔４〕ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物に由来する、〔１〕～〔３
〕のいずれかに記載の酵素。
〔５〕前記ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物が、ゴルドニバクター
・ウロリチンファシエンス（Gordonibacter urolithinfaciens）に属する微生物、ゴルドニバクター・パメラエアエ（Gordonibacter pamelaeae）に属する微生物、及びゴルドニ
バクター・フェシホミニス（Gordonibacter faecihominis）に属する微生物から成る群から選択される一又はそれ以上である、〔４〕に記載の酵素。
〔６〕配列番号１で表されるアミノ酸配列、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、又は、
配列番号１３で表されるアミノ酸配列、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む、
〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の酵素。
〔７〕配列番号１で表されるアミノ酸配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列、及び配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む、又は、
配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む、
〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の酵素。
〔８〕配列番号７で表される塩基配列、及び配列番号８で表される塩基配列を含む、又は、
配列番号１９で表される塩基配列、及び配列番号２０で表される塩基配列を含む、
ポリヌクレオチド。
〔９〕配列番号７で表される塩基配列、配列番号８で表される塩基配列、及び配列番号９で表される塩基配列を含む、又は、
配列番号１９で表される塩基配列、配列番号２０で表される塩基配列、及び配列番号２１で表される塩基配列を含む、
ポリヌクレオチド。
〔１０〕〔８〕又は〔９〕に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【００１０】
〔１１〕〔８〕又は〔９〕に記載のポリヌクレオチドを発現可能に保持した、又は〔１０〕に記載のベクターを発現可能に保持した、形質転換体。
〔１２〕宿主がロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物である、〔１１〕に記載
の形質転換体。
〔１３〕〔１１〕又は〔１２〕に記載の形質転換体を培養する工程を含む、〔８〕又は〔９〕に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質を製造する方法。
〔１４〕下記工程（Ｉ）を含む、ウロリチン類の４位の水酸基を脱水酸化する方法：
工程（Ｉ）：下記（ｉ）乃至（ｉｖ）から選択される一又はそれ以上を、４位に水酸基を有するウロリチン類に接触させ、４位の水酸基を脱水酸化する工程。
（ｉ）〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の酵素；
（ｉｉ）〔８〕又は〔９〕に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質；
（ｉｉｉ）前記（ｉ）に記載の酵素を、又は前記（ｉｉ）に記載のタンパク質を産生する微生物；
（ｉｖ）前記（ｉｉｉ）に記載の微生物の処理物。
〔１５〕前記ウロリチン類が、ウロリチンＭ５、ウロリチンＤ、又はウロリチンＥであり、
前記ウロリチン類の４位の水酸基が脱水酸化されて生成する生成物が、それぞれ、ウロリチンＭ６、ウロリチンＣ、及びウロリチンＭ７である、
〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕下記（１）及び（２）の性質を有する酵素。
（１）ウロリチン類の１０位の水酸基を脱水酸化する。
（２）メチルビオロゲン（ＭＶ）存在下に、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、及びフラビンアデニンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）から成る群から選択される一又はそれ以上で活性化される。
〔１７〕下記（３）及び（４）の性質を有する、〔１６〕に記載の酵素。
（３）至適ｐＨが５．０以上７．０以下である。
（４）至適温度が３７℃以上４２℃以下である。
〔１８〕ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物に由来する、〔１６〕又
は〔１７〕に記載の酵素。
〔１９〕前記ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物が、ゴルドニバクタ
ー・ウロリチンファシエンス（Gordonibacter urolithinfaciens）に属する微生物、ゴルドニバクター・パメラエアエ（Gordonibacter pamelaeae）に属する微生物、及びゴルド
ニバクター・フェシホミニス（Gordonibacter faecihominis）に属する微生物から成る群から選択される一又はそれ以上である、〔１８〕に記載の酵素。
〔２０〕配列番号４で表されるアミノ酸配列、及び配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む、又は、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列、及び配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む、
〔１６〕～〔１９〕のいずれかに記載の酵素。
（【００１１】以降は省略されています）

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