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公開番号2025086880
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-06-09
出願番号2024199752
出願日2024-11-15
発明の名称プライマーセット、キット及び判別方法
出願人国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
代理人個人,個人,個人
主分類C12N 15/11 20060101AFI20250602BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】近縁種からトマトキバガを判別するための新規のプライマーセット、キット及び判別方法を提供すること。
【解決手段】配列番号1に示す塩基配列と90%以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマー、配列番号2に示す塩基配列と90%以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマー、配列番号5に示す塩基配列と90%以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマー、及び配列番号6に示す塩基配列と90%以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマーを含む、プライマーセット。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
配列番号１に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号２に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号５に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号６に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマー
を含む、プライマーセット。
続きを表示（約 760 文字）【請求項２】
配列番号３に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号４に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマー
をさらに含む、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のプライマーセットを含む、トマトキバガ検出キット。
【請求項４】
被験昆虫がトマトキバガであるか否かを判別する方法であって、
プライマーセットを用いて、被験昆虫の核酸を鋳型としてＬＡＭＰ法を実施すること、
ＬＡＭＰ法により核酸の増幅が確認された場合に、被験昆虫がトマトキバガであると判別することを含み、
前記プライマーセットが、
配列番号１に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号２に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号５に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号６に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマーを含む、方法。
【請求項５】
前記プライマーセットが、配列番号３に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号４に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマーをさらに含む、請求項４に記載の方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、プライマーセット、キット及び判別方法に関する。
続きを表示（約 4,000 文字）【背景技術】
【０００２】
トマトキバ（Ｔｕｔａａｂｓｏｌｕｔａ）はトマトを中心としたナス科植物を加害するチョウ目キバガ科の害虫であり、トマトにおいては幼虫が葉や果実に穿孔して内部を食害することで収穫に大きな被害を与える。本種は幼虫が葉や果実内に潜行して成長することから、生産圃場へ侵入すると植物体に大きな被害が発生するまでに本種の侵入を確認することが困難である事から、圃場周辺での予察を行い本種の発生を迅速に確認することが必要である。
【０００３】
しかし、トマトキバガの形態形質に基づく種の同定に関しては専門知識や経験が必要であり、トラップで捕獲された近縁種の成虫との形態的な判別は生産現場においては困難である。そのため、栽培現場での簡便且つ迅速な同定法が求められている。
【０００４】
非特許文献１には、トマトキバガのＲｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ法を用いた同定方法が記載されている。しかしながら、Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ法を用いた方法では、Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲのための機器及び試薬が必要であり、栽培現場での迅速な同定には不向きである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
ＦＡＺｉｎｋｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｃｏｎｏｍｉｃＥｎｔｏｍｏｌｏｇｙ，１１３（３），２０２０，１４７９－１４８５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、近縁種からトマトキバガを判別するための新規のプライマーセット、キット及び判別方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、ＬＡＭＰ法によりトマトキバガに特異的な塩基配列を増幅することができる新規プライマーセットを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、例えば、以下の発明を提供する。
〔１〕
配列番号１に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号２に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号５に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号６に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマー
を含む、プライマーセット。
〔２〕
配列番号３に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号４に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマー
をさらに含む、〔１〕に記載のプライマーセット。
〔３〕
〔１〕又は〔２〕に記載のプライマーセットを含む、トマトキバガ検出キット。
〔４〕
被験昆虫がトマトキバガであるか否かを判別する方法であって、
プライマーセットを用いて、被験昆虫の核酸を鋳型としてＬＡＭＰ法を実施すること、
ＬＡＭＰ法により核酸の増幅が確認された場合に、被験昆虫がトマトキバガであると判別することを含み、
上記プライマーセットが、
配列番号１に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号２に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号５に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号６に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマーを含む、方法。
〔５〕
上記プライマーセットが、配列番号３に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号４に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプライマーをさらに含む、〔４〕に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ＬＡＭＰ法によりトマトキバガに特異的な塩基配列を増幅することで、トマトキバガを迅速に検出することができ、近縁種からトマトキバガを判別することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
表１のプライマーを設計した際のプライマーの設計模図である。アラインメントは、上からトマトキバガ（Ｔｕｔａａｂｓｏｌｕｔａ）、ヒヨドリジョウゴキバガ（ポルトガル）（ＳｃｒｏｂｉｐａｌｐａｅｒｇａｓｉｍａＰ）、ヒヨドリジョウゴキバガ（ポルトガル）（ＳｃｒｏｂｉｐａｌｐａｅｒｇａｓｉｍａＪ）、ジャガイモガ（Ｐｈｔｈｏｒｉｍａｅａｏｐｅｒｃｕｌｅｌｌａ）、ｔｏｍａｔｏｐｉｎｗｏｒｍ（Ｋｅｉｆｅｒｉａｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｅｌｌａ）、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）の配列をそれぞれ示す。
実施例１において、トマトキバガ及び近縁種のＤＮＡを鋳型とし、開発したプライマーのセットを用いてＬＡＭＰ法を行った際のリアルタイム濁度データを示すグラフである。ＤＮＡ増幅が進むと濁度が上昇する。１５～２０分で濁度が上昇しているサンプルがトマトキバガである。各サンプル番号は、以下のＤＮＡを鋳型とした結果を示す。１－４：ヒヨドリジョウゴキバガ、Ｓｐ・ｐ：トマトキバガ（ポジティブコントロール）、Ｓｎ・ｎ：ネガティブコントロール（蒸留水）。
実施例２において、トマトキバガ及び近縁種のＤＮＡを鋳型とし、開発したプライマーのセットを用いてＬＡＭＰ法を行った際のリアルタイム濁度データを示すグラフである。ＤＮＡ増幅が進むと濁度が上昇する。１５～２０分で濁度が上昇しているサンプルがトマトキバガである。各サンプル番号は、以下のＤＮＡを鋳型とした結果を示す。ＫＣ２４・ＫＷ２・ＫＷ５・ＫＣ５３：ジャガイモガ、ＫＣ５４・ＫＣ５５：トマトキバガ、ｎ：ネガティブコントロール（蒸留水）、ｐ：ポジティブコントロール（トマトキバガ）。
実施例３において、トマトキバガ及び近縁種のＤＮＡを鋳型とし、開発したプライマーのセットを用いてＬＡＭＰ法を行った際のリアルタイム濁度データを示すグラフである。ＤＮＡ増幅が進むと濁度が上昇する。１５～２０分で濁度が上昇しているサンプルがトマトキバガである。各サンプル番号は、以下のＤＮＡを鋳型とした結果を示す。ＫＣ２９・ＫＣ３０・ＫＣ３１・ＫＣ３２・ＫＣ３９・ＫＣ４０：トマトキバガ、ＫＣ３３：カレハチビマルハキバガ（Ｔｙｒｏｌｉｍｎａｓａｎｔｈｒａｃｏｎｅｓａ）、ＫＣ３４：ホソキバガ科の一種（Ｂａｔｒａｃｈｅｄｒａｓｐ．）、ＫＣ３５：ハマキガ科の一種、ＫＣ３６：ホソキバガ科の一種（Ｂａｔｒａｃｈｅｄｒａｓｐ．）、ＫＣ３７：ツツミノガ科の一種（Ｃｏｌｅｏｐｈｏｒａｓｐ．）、ＫＣ３８：ネマルハキバガ科の一種（Ｂｌａｓｔｏｂａｓｉｓｓｐ．）、ｎ：ネガティブコントロール、ｐ：ポジティブコントロール（トマトキバガ）。
実施例４において、トマトキバガ及び近縁種のＤＮＡを鋳型として、開発したプライマーのセットを用いてＬＡＭＰ法を行い、色相の変化によりトマトキバガを同定した結果を示す写真である。ＤＮＡが増幅すると反応液が赤色から黄色に変化する。各サンプル番号は、以下のＤＮＡを鋳型とした結果を示す。Ｔ：トマトキバガ、Ｐ：ジャガイモガ、Ｅ：ヒヨドリジョウゴキバ、Ｎ：ネガティブコントロール（蒸留水）。トマトキバガのみ反応液が赤色から黄色に変化した。
実施例５において、トマトキバガ及び近縁種のＤＮＡを鋳型とし、開発したプライマーのセットを用いてＬＡＭＰ法を行った際のリアルタイム濁度データを示すグラフである。ＤＮＡ増幅が進むと濁度が上昇する。１５～２０分で唯一濁度が上昇しているサンプルｐがポジティブコントロール（トマトキバガ）である。ｎはネガティブコントロールである。トマトキバガ以外の昆虫種のサンプルは、６０分間経過しても濁度の上昇は確認されなかった。
実施例５において、トマトキバガ及び近縁種のＤＮＡを鋳型とし、開発したプライマーのセットを用いてＬＡＭＰ法を行った際のリアルタイム濁度データを示すグラフである。ＤＮＡ増幅が進むと濁度が上昇する。１５～２０分で唯一濁度が上昇しているサンプルｐがポジティブコントロール（トマトキバガ）である。ｎはネガティブコントロールである。トマトキバガ以外の昆虫種のサンプルは、６０分間経過しても濁度の上昇は確認されなかった。
実施例５において、トマトキバガ及び近縁種のＤＮＡを鋳型とし、開発したプライマーのセットを用いてＬＡＭＰ法を行った際のリアルタイム濁度データを示すグラフである。ＤＮＡ増幅が進むと濁度が上昇する。１５～２０分で唯一濁度が上昇しているサンプルｐがポジティブコントロール（トマトキバガ）である。ｎはネガティブコントロールである。トマトキバガ以外の昆虫種のサンプルは、６０分間経過しても濁度の上昇は確認されなかった。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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