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公開番号2025013323
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-01-24
出願番号2024113374
出願日2024-07-16
発明の名称宣威ハム由来の抗酸化ペプチド及びその調製法と活性測定方法
出願人合肥工業大学,HeFei University of Technology
代理人弁理士法人スズエ国際特許事務所
主分類C07K 19/00 20060101AFI20250117BHJP(有機化学)
要約【課題】宣威ハム由来の抗酸化ペプチド、及びその調製法と活性測定方法を提供する。
【解決手段】本発明は、宣威ハム由来の特定のアミノ酸配列を有する抗酸化ペプチドを提供する。本発明は、剛体連結ペプチドと柔軟連結ペプチドを使用して宣威ハム由来のヘキサペプチドを連結し、ペプチド鎖を成長させて遺伝子組換え発現に適したものにすると同時に、組換えタンパク質中の標的ポリペプチドの割合を増加させ、発現量を大幅に増加させ、次に、剛体連結ペプチドはαヘリックス構造を持っており、これにより直列連結後の抗酸化ペプチドが安定した二次構造を形成しやすくなり、活性な機能ドメインを効果的に分離することができ、柔軟連結ペプチドは主にグリシンGlyで構成されており、分子量が小さいため、ポリペプチド骨格構造の自由度が確保される。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
宣威ハム由来の抗酸化ペプチドであって、そのアミノ酸配列を配列番号１または配列番号２に示すことを特徴とする宣威ハム由来の抗酸化ペプチド。
続きを表示（約 2,300 文字）【請求項２】
対応する遺伝子配列を配列番号３または配列番号４に示すことを特徴とする請求項１に記載の宣威ハム由来の抗酸化ペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの調製法であって、
宣威ハムペプチドのアミノ酸配列に従って、剛体連結ペプチドまたは柔軟連結ペプチドを使用して宣威ハムペプチドを６倍体に連結し、標的遺伝子を取得し、前記宣威ハムペプチド、剛体連結ペプチド及び柔軟連結ペプチドの配列を配列番号９～１１に示し、前記標的遺伝子の配列を配列番号３または配列番号４に示すステップ（１）と、
標的遺伝子および原核生物発現プラスミドｐＥＴ－２８ａ（＋）を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで二重酵素切断し、ＤＮＡリガーゼを介して接続して、原核生物組換え発現ベクターｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｇ６、ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｒ６を得るステップ（２）と、
原核生物組換え発現ベクターをヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換し、組換え工学菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｇ６、ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｒ６を構築するステップ（３）と、
コロニーＰＣＲにより組換え発現ベクターの形質転換が成功したことを検証するステップ（４）と、
工学菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｇ６、ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｒ６の発現においてＨｉｓタグ付き直列連結組換えポリペプチドの発現を誘導するステップ（５）と、
発現されたＨｉｓタグ付き融合タンパク質を、ニッケルイオンアフィニティークロマトグラフィーカラムを使用して精製し、タンパク質をロードすると、Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質がニッケルカラムに特異的に結合し、不純物タンパク質はニッケルカラムへの非特異的結合により流出し、イミダゾール勾配溶出を使用し、イミダゾールとＮｉ
２＋
の組み合わせが競合的にニッケルカラムに結合し、それによって融合タンパク質が放出され、溶出液を収集するステップ（６）と、
ＲＰ－ＨＰＬＣを純度試験に使用して、高純度の直列連結組換え抗酸化ペプチドを取得するステップ（７）と、を含むことを特徴とする宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの調製法。
【請求項４】
前記ステップ（４）のコロニーＰＣＲで使用するプライマーは
ＸＨＰ－Ｇ６上流プライマー：５’－ＴＧＡＡＴＣＣＧＣＣＧＡＡＡＴＴＣＧＡＣＧＡＡＧ－３’、下流プライマー：５’－ＴＣＴＴＴＣＧＣＡＧＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧ－３’、
ＸＨＰ－Ｒ６上流プライマー：５’－ＣＡＴＡＴＧＡＡＴＣＣＧＣＣＧＡＡＡＴＴＣＧ－３’、下流プライマー：５’－ＣＴＣＧＡＧＡＴＣＧＡＡＴＴＴＴＧＧＣＧＧ－３’であり、
配列を配列番号５～８に示すことを特徴とする請求項３に記載の宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの調製法。
【請求項５】
ポリペプチドの発現を誘導するための発酵条件は、イソプロピルチオガラクトピラノシドを最終濃度０．５ｍｍｏｌ／Ｌまで添加し、３７℃、２２０ｒ／分で８時間培養することであることを特徴とする請求項４に記載の宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの調製法。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの活性測定方法であって、
ヒドロキシルラジカル消去法とＤＰＰＨラジカル消去法を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
前記ヒドロキシルラジカル消去法は、組換えポリペプチドサンプル１ｍＬを硫酸第一鉄１ｍＬおよび過酸化水素１ｍＬと混合し、３７℃で１０分間保持した後、溶液をサリチル酸１ｍＬと混合し、対照群では、サンプル溶液の代わりに蒸留水を使用し、３０分間インキュベートした後、５１０ｎｍでの吸光度を測定することであり、
ヒドロキシルラジカル消去活性は次の式に従って計算され、
TIFF
2025013323000007.tif
17
156
ここで、Ａｉ：サンプルの吸光度、
Ａ０：ブランク対照群の吸光度であることを特徴とする請求項６に記載の宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの活性測定方法。
【請求項８】
前記ＤＰＰＨラジカル消去法は、一定量のＤＰＰＨを秤量し、無水エタノールを用いて０．０４ｍｇ／ｍＬのＤＰＰＨ溶液を調製し、１ｍｇ／ｍＬの異なる濃度の組換えポリペプチド溶液２ｍＬを取り、ＤＰＰＨ溶液２ｍＬを加えて均一に混合し、室温で３０分間放置した後、５０００ｒ／ｍｉｎで１０分間遠心分離し、上清を取り、５１７ｎｍでの吸光度を測定し、Ｖｃをポジティブコントロールとして使用することであり、サンプルによるＤＰＰＨラジカルの消去率は、次の式を使用して計算され、
TIFF
2025013323000008.tif
12
165
Ａ
０
は、２ｍＬ無水エタノール＋２ｍＬＤＰＰＨ溶液の吸光度であり、
Ａ
１
は、２ｍＬサンプル液＋２ｍＬＤＰＰＨ溶液の吸光度であり、
Ａ
２
は、２ｍＬサンプル溶液＋２ｍＬ無水エタノールの吸光度であることを特徴とする請求項７に記載の宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの活性測定方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸化ペプチドの技術分野に関し、具体的には、宣威ハム由来の抗酸化ペプチド、調製法と活性測定方法に関する。
続きを表示（約 2,200 文字）【背景技術】
【０００２】
今日の社会では、人々の健康と長寿への関心がますます高まっており、抗酸化剤はこの分野で広く関心を集めている。酸化ストレスは、ラジカルや酸化物質の過剰な蓄積によって引き起こされる生化学的不均衡であり、脂質の酸化、タンパク質の酸化、ＤＮＡ損傷等を引き起こす可能性がある。これらの酸化プロセスは、心血管疾患、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、がんなどの多くの病気の発症と密接に関係している。近年、研究者は生物活性ペプチドに注目し続けており、さまざまな生ハムからさまざまな生物活性ペプチドが単離・同定され、豊富なアミノ酸配列と、抗酸化作用、血圧降下作用、脂質低下作用、血糖降下作用などのさまざまな生物学的機能を有しており、潜在的な健康上の利点があると考えられている。例えば、非特許文献１は、スペイン産生ハムから抽出した分子量１７００Ｄａ以下のペプチド抽出物が、降圧作用と抗酸化作用を示すことを発見し、非特許文献２は、金華ハムから抽出・単離された天然ペプチドが、高いラジカル消去活性を持っていることを発見する。これらの活性ペプチドの分子量は４００～２０００Ｄａ、配列長は５～２０アミノ酸であり、機能性食品や病気の治療薬として利用できる。特許文献１は、分子量＜３．０ｋＤａの４２個のペプチドセグメントを含む生ハム由来の抗酸化ペプチド複合体を開示し、最も高い割合を有する３つのペプチドセグメントはそれぞれ、２３．５６％を占める生物活性ペプチド１、１３．６４％を占める生物活性ペプチド２、１２．９８％を占める生物活性ペプチド３であり、前記生物活性ペプチド１のアミノ酸配列はＬＧＥＨＮＩＤＶＬＥＧＮＥＱＦＩＮＡＡＫ、前記生物活性ペプチド２のアミノ酸配列はＧＨＹＴＥＧＡＥＬＶＤＳＶＬＤＶＶＲ、前記生物活性ペプチド３のアミノ酸配列はＤＬＶＩＬＬＹＥＴＡＬＬＳＳＧＦＳＬＥＤＰＱＴＨＡＮＲである。
【０００３】
しかしながら、ほとんどの抗酸化ペプチドと同様に、ハムから単離・抽出されたポリペプチドの収量が低く、コストが高く、単離プロセスは時間がかかるため、大規模に調製することは困難である。現在では、ほとんどの抗酸化ペプチドはまだ実験室規模の研究段階にあり、この分離および抽出方法で抗酸化ペプチドを取得しても工業生産の要件を満たすことができないことが示されている。さらに、ハムから単離された抗酸化ペプチドの配列には通常５～２０個のアミノ酸が含まれており、これらは比較的短く、大腸菌発現系のプロテアーゼやペプチダーゼによって容易に分解される。したがって、これらのペプチドを直接発現させることは困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
ＥｌｉｚａｂｅｔｈＥｓｃｕｄｅｒｏ（Ｅｓｃｕｄｅｒｏ，Ｅ．，Ａｒｉｓｔｏｙ，Ｍ．－Ｃ．，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．，Ａｒｉｈａｒａ，Ｋ．，＆Ｔｏｌｄｒａ（ａはアキュートアクセント付き），Ｆ．（２０１２）．ＡｎｔｉｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅｅｆｆｅｃｔａｎｄａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｐｅｐｔｉｄｅｆｒａｃｔｉｏｎｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍＳｐａｎｉｓｈｄｒｙ－ｃｕｒｅｄｈａｍ．ＭｅａｔＳｃｉｅｎｃｅ，９１（３），３０６－３１１．）
Ｃｈａｏ－Ｚｈｉ（Ｚｈｕ，Ｃ．Ｚ．，Ｚｈａｎｇ，Ｗ．Ｇ．，Ｋａｎｇ，Ｚ．Ｌ．，Ｚｈｏｕ，Ｇ．Ｈ．，＆Ｘｕ，Ｘ．Ｌ．（２０１４）．ＳｔａｂｉｌｉｔｙｏｆａｎａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｐｅｐｔｉｄｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍＪｉｎｈｕａｈａｍ．ＭｅａｔＳｃｉｅｎｃｅ，９６（２），７８３－７８９）
【特許文献】
【０００５】
中国特許出願公開第１１５２６０２８８Ａ号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
オリゴペプチドは直接組換え発現過程で正常に転写・翻訳されにくく、大腸菌発現系のプロテアーゼやペプチダーゼにより分解されやすいという問題を解決し、ポリペプチドの活性を向上させるために、本発明の第一の目的は、宣威ハム由来の抗酸化ペプチドを提供することである。
【０００７】
本発明の第二の目的は、宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの調製法を提供することである。
【０００８】
本発明の第三の目的は、宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの活性測定方法を提供することである。
【０００９】
本発明は、宣威ハムペプチドを原料として使用し、直列連結により繰り返し発現させ、異なる連結方法を使用して同じペプチド配列を繰り返し連結してポリペプチド分子を形成し、その安定性、生物学的活性および収量を増加させることができる。本発明は、大腸菌において宣威ハムペプチド遺伝子の発現ベクターを構築することにより、宣威ハムペプチドの高レベル発現を実現する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明は以下の技術解決手段を提供する。
（【００１１】以降は省略されています）

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