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公開番号2025011252
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-01-23
出願番号2024180003,2020178281
出願日2024-10-15,2020-10-23
発明の名称Xkr4ポリペプチド、XRCC4ポリペプチド、および目的とする表現型に対応する遺伝子を特定する方法
出願人国立大学法人京都大学
代理人個人,個人
主分類C07K 14/47 20060101AFI20250116BHJP(有機化学)
要約【課題】脂質スクランブル活性に関係する分子を特定する方法を提供する。
【解決手段】Xkr4ポリペプチドであって、(A)特定のアミノ酸配列からなるポリペプチド;または(B)前記(A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、欠失、置換、または付加もしくはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を有し、かつ前記(A)のアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を示し、かつXRCC4ポリペプチドとの相互作用なしに細胞膜において脂質スクランブル活性を示し得るポリペプチドである、Xkr4ポリペプチド。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
Ｘｋｒ４ポリペプチドであって、
（Ａ）配列番号３～５および３７～３９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（Ｂ）前記（Ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、欠失、置換、または付加もしくはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を有し、かつ前記（Ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示し、かつＸＲＣＣ４ポリペプチドとの相互作用なしに細胞膜において脂質スクランブル活性を示し得るポリペプチド
である、Ｘｋｒ４ポリペプチド。
続きを表示（約 1,100 文字）【請求項２】
ＸＲＣＣ４ポリペプチドであって、
（ａ）配列番号７～１２および４２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）前記（ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、欠失、置換、または付加もしくはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を有し、かつ前記（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示し、かつＣ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドとの相互作用により細胞膜における脂質スクランブル活性を誘発し得るポリペプチド
である、ＸＲＣＣ４ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号６に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基の番号付けに従って、２７０位のアルギニンを含む、請求項２に記載のＸＲＣＣ４ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号６に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基の番号付けに従って、２６５位にメチオニンを含まない、請求項２または３に記載のＸＲＣＣ４ポリペプチド。
【請求項５】
請求項１に記載のＸｋｒ４ポリペプチド、あるいは請求項２～４のいずれか一項に記載のＸＲＣＣ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞、または請求項６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
請求項２～４のいずれか一項に記載のＸＲＣＣ４ポリペプチド；前記ＸＲＣＣ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；および前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１つを含む、Ｘｋｒ４を活性化するための組成物。
【請求項９】
アポトーシスの抑制が関与する状態または疾患の治療または予防用である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（１）請求項１に記載のＸｋｒ４ポリペプチドを発現する細胞と、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節する可能性のある候補物質とを接触させること；
（２）前記候補物質と接触させた前記細胞における脂質スクランブル活性を測定すること；および
（３）前記脂質スクランブル活性が、前記候補物質を接触させていない前記細胞における脂質スクランブル活性と比較して、低い場合または高い場合に、前記候補物質をＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節する物質として選択すること；
を含む、スクリーニング方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本開示は、Ｘｋｒ４ポリペプチドまたはＸＲＣＣ４ポリペプチド、それらをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、あるいは前記ポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む宿主細胞に関する。本開示はまた、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節（例えば阻害または誘発）する物質のスクリーニング方法に関する。本開示はまた、Ｘｋｒ４を活性化するための組成物に関する。本開示はまた、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質のスクリーニングするためのキットに関する。本開示はさらに、目的とする表現型に対応する遺伝子を特定する方法に関する。
続きを表示（約 5,200 文字）【背景技術】
【０００２】
脳の発生段階では、多数の細胞死が観察され、その細胞死のほとんどがアポトーシスである。アポトーシスは、核の断片化、細胞質の凝集および分断を特徴する細胞死である。アポトーシスでは、ネクローシスなどの他の細胞死と比べて、細胞が組織からすみやかに除去される。脳の発生段階におけるアポトーシスの欠陥は、注意欠陥・多動性障害（ＡＤＨＤ）を含む神経発達障害または行動障害と関連し得る。過剰なアポトーシスは、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）および筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性疾患と関連し得る。
【０００３】
真核生物のもつ細胞膜はリン脂質二重膜から構成され、リン脂質が非対称に分布している。このリン脂質の非対称的な分布は、ホスファチジルセリンなどのアミノリン脂質を細胞膜の内側（細胞質側）に輸送する酵素であるフリッパーゼにより維持されていると考えられている。細胞がアポトーシス刺激を受けると、リン脂質の非対称的な分布が崩壊し、細胞膜の内側にあったホスファチジルセリンが細胞表面に露出され、食細胞に貪食される。アポトーシスによるホスファチジルセリンの露出に関与するタンパク質であるＸｋｒ８が同定された（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
ＷＯ２０１４／０７７２７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本開示は、脂質スクランブル活性に関係する分子を特定することを１つの目的とする。本開示は、脂質スクランブル活性に関係する分子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記ポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む宿主細胞を提供することを１つの目的とする。本開示は、脂質スクランブル活性を調節（例えば阻害または誘発）する物質をスクリーニングする方法を提供することを１つの目的とする。本開示は、Ｘｋｒ４を活性化するための組成物を提供することを１つの目的とする。本開示は、脂質スクランブル活性を阻害する物質のスクリーニングするためのキットを提供することを目的とする。本開示はさらに、目的とする表現型に対応する遺伝子を特定する方法を提供することを１つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、以下の発明を提供する。
［項１］
Ｘｋｒ４ポリペプチドであって、
（Ａ）配列番号３～５および３７～３９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（Ｂ）前記（Ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、欠失、置換、または付加もしくはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を有し、かつ前記（Ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示し、かつＸＲＣＣ４ポリペプチドとの相互作用なしに細胞膜において脂質スクランブル活性を示し得るポリペプチド
である、Ｘｋｒ４ポリペプチド。
［項２］
ＸＲＣＣ４ポリペプチドであって、
（ａ）配列番号７～１２および４２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）前記（ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、欠失、置換、または付加もしくはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を有し、かつ前記（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示し、かつＣ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドとの相互作用により細胞膜における脂質スクランブル活性を誘発し得るポリペプチド
である、ＸＲＣＣ４ポリペプチド。
［項３］
配列番号６に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基の番号付けに従って、２７０位のアルギニンを含む、項２に記載のＸＲＣＣ４ポリペプチド。
［項４］
配列番号６に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基の番号付けに従って、２６５位にメチオニンを含まない、項２または３に記載のＸＲＣＣ４ポリペプチド。
［項５］
項１に記載のＸｋｒ４ポリペプチド、あるいは項２～４のいずれか一項に記載のＸＲＣＣ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
［項６］
項５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
［項７］
項５に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞、または項６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
［項８］
項２～４のいずれか一項に記載のＸＲＣＣ４ポリペプチド；前記ＸＲＣＣ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；および前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１つを含む、Ｘｋｒ４を活性化するための組成物。
［項９］
アポトーシスの抑制が関与する状態または疾患の治療または予防用である、項８に記載の組成物。
【０００７】
［項１０］
Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（１）項１に記載のＸｋｒ４ポリペプチドを発現する細胞と、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節する可能性のある候補物質とを接触させること；
（２）前記候補物質と接触させた前記細胞における脂質スクランブル活性を測定すること；および
（３）前記脂質スクランブル活性が、前記候補物質を接触させていない前記細胞における脂質スクランブル活性と比較して、低い場合または高い場合に、前記候補物質をＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節する物質として選択すること；
を含む、スクリーニング方法。
［項１１］
前記Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節する物質が、前記比較において、前記脂質スクランブル活性が前記候補物質を接触させていない前記細胞における脂質スクランブル活性よりも低い場合、前記調節する物質は、アポトーシスの促進が関与する状態または疾患の治療または予防のための薬剤候補である、項１０に記載のスクリーニング方法。
［項１２］
Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を誘発する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（１）Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドであって、（α）配列番号２または３６に記載のアミノ酸配列からなるＣ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチド、または（β）前記（α）ポリペプチドのアミノ酸配列において、欠失、置換、または付加もしくはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を有し、かつ前記（α）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示し、かつＸＲＣＣ４ポリペプチドとの相互作用により細胞膜において脂質スクランブル活性を示し得るＣ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドを発現する細胞と、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を誘発する可能性のある候補物質とを接触させること；
（２）前記候補物質と接触させた前記細胞における脂質スクランブル活性を測定すること；および
（３）前記脂質スクランブル活性が、前記候補物質を接触させていない前記細胞における脂質スクランブル活性と比較して高い場合に、前記候補物質をＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を誘発する物質として選択すること；
を含む、スクリーニング方法。
【０００８】
［項１３］
Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（１）項２～４のいずれか一項に記載のＸＲＣＣ４ポリペプチドが導入され、Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドを発現する細胞と、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する可能性のある候補物質とを接触させること；
（２）前記細胞における脂質スクランブル活性を測定すること；および
（３）前記脂質スクランブル活性が、前記候補物質と接触させていな前記細胞における脂質スクランブル活性よりも低い場合に、前記候補物質をＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質として選択すること；
を含む、スクリーニング方法。
［項１４］
Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（１）Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する可能性のある候補物質の存在下で、項２～４のいずれか一項に記載のＸＲＣＣ４ポリペプチドと、Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドとを接触させること；
（２）前記ＸＲＣＣ４ポリペプチドと前記Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドとの結合を測定すること；および
（３）前記ＸＲＣＣ４ポリペプチドと前記Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドとの前記結合が、前記候補物質の非存在下で前記ＸＲＣＣ４ポリペプチドと前記Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドとを接触させた場合の結合よりも低い場合に、前記候補物質を、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質として選択すること；
を含む、スクリーニング方法。
［項１５］
前記脂質スクランブル活性が、リン脂質または糖脂質の取込み活性、または細胞膜の内側に位置するリン脂質の露出活性である、項１０～１４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【０００９】
［項１６］
項１４または１５に記載のＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質のスクリーニングのためのキットであって、
項２～４のいずれか一項に記載のＸＲＣＣ４ポリペプチド；前記ＸＲＣＣ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター；および前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞、または前記発現ベクターを含む宿主細胞からなる群より選択される少なくとも１つを含む、キット。
［項１７］
目的とする表現型に対応する遺伝子を特定する方法であって、
（ａ）細胞のゲノムＤＮＡの複数種の遺伝子のヌクレオチド配列に対応する少なくとも１種のガイド配列を含むガイドＲＮＡを含む、ガイドＲＮＡライブラリーを準備すること；
（ｂ）前記ガイドＲＮＡライブラリーが導入された細胞集団を得ること；
（ｃ）前記細胞集団から目的とする表現型に基づいて細胞を選択すること；
（ｄ）選択した細胞からゲノムＤＮＡを回収すること；
（ｅ）工程（ｂ）～（ｄ）が所定回数実施されるまで、回収したゲノムＤＮＡから新たなガイドＲＮＡライブラリーを準備し、前記新たなガイドＲＮＡライブラリーを用いて工程（ｂ）～（ｄ）を実施すること；
（ｆ）工程（ｂ）～（ｄ）が所定回数実施された場合に、回収したゲノムＤＮＡ中のガイド配列を決定すること；および
（ｇ）決定されたガイド配列に対応する遺伝子を、前記目的とする表現型に対応する遺伝子として特定する工程を含み、
前記所定回数が少なくとも２回である、特定方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
図１（ａ）は、ＰＬＢ細胞（ｐａｒｅｎｔａｌ）における脂質スクランブルアッセイを示すグラフである。図１（ｂ）は、Ｘｋｒ４ＷＴを発現するＰＬＢ細胞における脂質スクランブルアッセイを示すグラフである。図１（ｃ）はＸｋｒ４ΔＣを発現するＰＬＢ細胞における脂質スクランブルアッセイを示すグラフである。図１（ｄ）は、ＰＬＢ細胞（ｐａｒｅｎｔａｌ）における蛍光アネキシンＶ染色アッセイの結果を示すグラフである。図１（ｅ）は、Ｘｋｒ４ＷＴを発現するＰＬＢ細胞における蛍光アネキシンＶ染色アッセイの結果を示すグラフである。図１（ｆ）はＸｋｒ４ΔＣを発現するＰＬＢ細胞における蛍光アネキシンＶ染色アッセイの結果を示すグラフである。薄い灰色はＳＴＳ処理なし（コントロール）を示し、濃い灰色はＳＴＳ処理あり（アポトーシス刺激）を示す。バーはＰＣ取込み、ＰＳ露出が陽性の領域を示す。
図２上段は、生き状態のＸｋｒ４ＷＴ－ＧＦＰを発現するＰＬＢ細胞をそれぞれ示す顕微鏡写真である。図２下段は、生き状態のＸｋｒ４ΔＣ－ＧＦＰを発現するＰＬＢ細胞をそれぞれ示す共焦点顕微鏡写真である。図２左列は、ＧＦＰ由来の蛍光を示す顕微鏡写真である。図２中列は、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）を示す顕微鏡写真である。図２右は、蛍光写真とＤＩＣ写真との重合せ写真を示す。スケールバーは１０μｍを示す。
（【００１１】以降は省略されています）

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