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公開番号2024163122
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-11-21
出願番号2024128853,2022092414
出願日2024-08-05,2013-12-12
発明の名称配列操作のための改善された系、方法および酵素組成物のエンジニアリングおよび最適化
出願人ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド,マサチューセッツ・インスティトュート・オブ・テクノロジー,プレジデントアンドフェローズオブハーバードカレッジ
代理人弁理士法人特許事務所サイクス
主分類C12N 15/09 20060101AFI20241114BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】1つには、多彩な用途の配列ターゲティングのための代替的で堅牢な系および技術の必要性に対処し、関連する利点を提供すること。
【解決手段】本発明は、配列の操作および/または標的配列の活性のための系、方法、および組成物のエンジニアリングおよび最適化を提供する。特にCasオルソログ酵素を含むCRISPR複合体の成分に関する組成物および方法が提供される。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物であって、
（Ａ）Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列に作動可能に結合している第１の調節エレメントであって、前記ポリヌクレオチド配列は、
（ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、
（ｂ）ｔｒａｃｒメイト配列、および
（ｃ）ｔｒａｃｒ配列
を含む第１の調節エレメント、および
ＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメント
を含み、
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、５’から３’配向で配置されており、
成分ＩおよびＩＩは、系の同一または異なるベクター上にあり、
転写されると前記ｔｒａｃｒメイト配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列が前記標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、
前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的配列にハイブリダイズされる前記ガイド配列、および（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされる前記ｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成している前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物
または
（Ｂ）Ｉ．第１の調節エレメントであって、
（ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、および
（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒメイト配列
に作動可能に結合している第１の調節エレメント、
ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメント、および
ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列に作動可能に結合している第３の調節エレメント
を含み、
成分Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩは、系の同一または異なるベクター上にあり、
転写されると前記ｔｒａｃｒメイト配列は前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列が前記標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、
前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的配列にハイブリダイズされる前記ガイド配列、および（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされる前記ｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成している前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、
（Ａ）または（Ｂ）において、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロケタ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パービバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラティフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）からなる群に属する属のＣａｓ９オルソログである１つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物。
続きを表示（約 1,700 文字）【請求項２】
改変ＣＲＩＳＰＲ酵素であって、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロケタ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パービバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラティフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）からなる群に属する属のＣａｓ９オルソログであり、対応する野生型ＣＲＩＳＰＲ酵素との差異は、以下：
前記改変ＣＲＩＳＰＲ酵素は、野生型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較してトランケートされており、または
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、少なくとも５００アミノ酸、少なくとも８００～８９９アミノ酸、少なくとも９００～９９９アミノ酸、少なくとも１０００～１０９９アミノ酸、少なくとも１１００～１１９９アミノ酸、少なくとも１２００～１２９９アミノ酸、少なくとも１３００～１３９９アミノ酸、少なくとも１４００～１４９９アミノ酸、少なくとも１５００～１５９９アミノ酸、少なくとも１６００～１６９９アミノ酸または少なくとも２０００アミノ酸の長さを有し、および／または
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、前記標的配列の局在における両方の鎖の開裂を指向するヌクレアーゼであり、または前記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、前記標的配列の局在における一方の鎖の開裂を指向するニッカーゼであり、および／または
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、コドン最適化されているか、または真核細胞中の発現のためにコドン最適化されており、および／または
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の突然変異を含み、および／または
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、キメラＣＲＩＳＰＲ酵素を含む、
を含む、改変ＣＲＩＳＰＲ酵素。
【請求項３】
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、前記酵素の任意のドメイン中の１つ以上の突然変異を有する、請求項１に記載の組成物、または請求項２に記載の酵素。
【請求項４】
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、触媒ドメイン中の１つ以上の突然変異を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物または酵素。
【請求項５】
前記１つ以上の突然変異が、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、ＲｕｖＣＩＩＩまたはＨＮＨドメイン中に存在する、請求項３または４に記載の組成物または酵素。
【請求項６】
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、位置Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３ＡまたはＤ９８６ＡにおけるＳｐＣａｓ９の位置ナンバリングに対応する１つ以上の突然変異を含む、請求項４または５に記載の組成物または酵素。
【請求項７】
前記酵素が、機能ドメインをさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物または酵素。
【請求項８】
前記機能ドメインが、転写アクチベータードメインである、請求項７に記載の組成物または酵素。
【請求項９】
前記転写アクチベータードメインが、ＶＰ６４である、請求項８に記載の組成物または酵素。
【請求項１０】
前記機能ドメインが、転写リプレッサードメインである、請求項７～９のいずれか一項に記載の組成物または酵素。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願および参照による組み込み
本出願は、２０１３年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／８３６，１０１号明細書、標題ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧＡＮＤＯＰＴＩＭＩＺＡＴＩＯＮＯＦＩＭＰＲＯＶＥＤＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳＡＮＤＥＮＺＹＭＥＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＦＯＲＳＥＱＵＥＮＣＥＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮの優先権を主張する。本出願は、米国仮特許出願第６１／７５８，４６８号明細書；同第６１／７６９，０４６号明細書；同第６１／８０２，１７４号明細書；同第６１／８０６，３７５号明細書；同第６１／８１４，２６３号明細書；同第６１／８１９，８０３号明細書および同第６１／８２８，１３０号明細書の優先権も主張し、それぞれ標題ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧＡＮＤＯＰＴＩＭＩＺＡＴＩＯＮＯＦＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳＡＮＤＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＦＯＲＳＥＱＵＥＮＣＥＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮであり、それぞれ２０１３年１月３０日；２０１３年２月２５日、２０１３年３月１５日；２０１３年３月２８日、２０１３年４月２０日；２０１３年５月６日および２０１３年５月２８日に出願されたものである。本出願は、米国仮特許出願第６１／７３６，５２７号明細書および同第６１／７４８，４２７号明細書の優先権も主張し、両方とも標題ＳＹＳＴＥＭＳＭＥＴＨＯＤＳＡＮＤＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＦＯＲＳＥＱＵＥＮＣＥＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮであり、それぞれ２０１２年１２月１２日および２０１３年１月２日に出願されたものである。それぞれ２０１３年３月１５日および２０１３年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／７９１，４０９号明細書および同第６１／８３５，９３１号明細書の優先権も主張される。
それぞれ２０１３年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／８３６，１２７号明細書、同第６１／８３５，９３６号明細書、同第６１／８３６，０８０号明細書、同第６１／８３６，１２３号明細書、および同第６１／８３５，９７３号明細書が参照される。
続きを表示（約 3,900 文字）【０００２】
上記の出願、ならびにそれらの出願においてまたはそれらの審査中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）およびその出願引用文献において引用または参照される全ての文献、ならびに本明細書において引用または参照される全ての文献（「本明細書引用文献」）、および本明細書引用文献において引用または参照される全ての文献は、本明細書においてまたは本明細書に参照により組み込まれる任意の文献において挙げられる任意の製品に関する任意の製造業者の指示書、説明書、製品仕様書、および製品シートと一緒に、参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施において用いることができる。より具体的には、全ての参照文献は、それぞれの個々の文献が個別具体的に参照により組み込まれることが示されるような程度で参照により組み込まれる。
【０００３】
本発明は、一般に、クラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）およびその成分に関する配列ターゲティング、例えば、ゲノム摂動または遺伝子編集を含む遺伝子発現の制御に使用される系、方法および組成物のエンジニアリングおよび最適化に関する。
【０００４】
連邦政府により資金提供された研究に関する記述
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ）により助成されたＮＩＨパイオニアアワード（１ＤＰ１ＭＨ１００７０６）のもと政府支援によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００５】
ゲノムシーケンシング技術および分析法の近年の進歩により、多様な範囲の生物学的機能および疾患に関連する遺伝因子を分類およびマッピングする技能が顕著に加速されている。正確なゲノムターゲティング技術は、個々の遺伝子エレメントの選択的摂動を可能とすることにより因果的遺伝子変異の体系的なリバースエンジニアリングを可能とするため、ならびに合成生物学、バイオテクノロジーおよび医薬用途を進歩させるために必要とされる。ゲノム編集技術、例えば、デザイナー亜鉛フィンガー、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）、またはホーミングメガヌクレアーゼがターゲティングされるゲノム摂動の産生に利用可能であるが、安価で、設定が容易で、スケーラブルで、真核ゲノム内の複数位置をターゲティングしやすい新たなゲノムエンジニアリング技術が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
国際公開第９７／０３２１１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系（両方の用語は、本出願全体にわたり互換的に使用される）は特異的配列をターゲティングするためにカスタムタンパク質の生成を要求するのではなく、単一Ｃａｓ酵素を短鎖ＲＮＡ分子によりプログラミングして特異的ＤＮＡ標的を認識させることができ、換言すると、Ｃａｓ酵素は、前記短鎖ＲＮＡ分子を使用して特異的ＤＮＡ標的にリクルートすることができる。ゲノムシーケンシング技術および分析法のレパートリーへのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の付加により方法論が顕著に簡易化され、多様な範囲の生物学的機能および疾患に関連する遺伝因子を分類およびマッピングする技能が加速される。有害効果を有さずにゲノム編集にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を有効に利用するため、特許請求される本発明の態様であるそれらのゲノムエンジニアリングツールのエンジニアリングおよび最適化の態様を理解することが重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、多彩な用途の配列ターゲティングのための代替的で堅牢な系および技術が差し迫って必要とされている。本発明の態様は、この必要性に対処し、関連する利点を提供する。例示的なＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、限定されるものではないが、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロケタ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パービバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラティフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）が挙げられる属のＣａｓオルソログ、例えば、Ｃａｓ９オルソログである。ガイド配列は、次いでｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合している。
【０００９】
一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントを使用する方法を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチドを改変するための有効な手段を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、広範な有用性、例として、非常に多数の細胞タイプ中の標的ポリヌクレオチドの改変（例えば、欠失、挿入、転座、不活性化、活性化、抑制、メチル化の変更、規定部分の移動）を有する。したがって、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、例えば、遺伝子またはゲノム編集、遺伝子調節、遺伝子療法、薬物送達、薬物スクリーニング、疾患診断、および予後における幅広い用途範囲を有する。本発明の好ましい態様において、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、限定されるものではないが、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロケタ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パービバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラティフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）が挙げられる属のＣａｓ酵素、好ましくは、Ｃａｓ９オルソログを含む。
【００１０】
本発明の態様は、最適化機能を有するＣＲＩＳＰＲ酵素に関する。Ｃａｓ酵素であるＣＲＩＳＰＲ酵素に関して、本発明の好ましい実施形態は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系における改善された標的特異性を有するＣａｓ９オルソログに関する。このことは、限定されるものではないが、最適な活性を有するガイドＲＮＡの設計および調製、規定の長さのＣａｓ９酵素の選択、Ｃａｓ９酵素のトランケーション（Ｃａｓ９をコードする核酸分子をトランケートすることにより、対応する野生型Ｃａｓ９酵素よりもＣａｓ９の長さを短くする）、ならびにキメラＣａｓ９酵素（調整された特異性を有するキメラ酵素を得るために酵素の異なる部分が異なるオルソログ間でスワップまたは交換されている）の生成が挙げられるアプローチにより達成することができる。本発明の態様はまた、Ｃａｓ９オルソログ酵素の標的特異性を改善する方法またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を設計する方法であって、最適な活性を有するガイドＲＮＡを設計もしくは調製することおよび／または対応する野生型Ｃａｓ９よりも小さいサイズもしくは長さを有するＣａｓ９オルソログ酵素を選択もしくは調製すること（それにより、対応する野生型Ｃａｓ９よりも送達ベクター中のそのコード配列が短いため、それをコードする核酸の送達ベクター中へのパッケージングが向上する）、および／またはキメラＣａｓ９酵素を生成することを含む方法に関する。
（【００１１】以降は省略されています）

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