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公開番号2024135165
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-10-04
出願番号2023045715
出願日2023-03-22
発明の名称微生物および微生物由来の有機物汚れの検出及び残留評価技術
出願人鹿島建設株式会社
代理人個人,個人,個人
主分類C12Q 1/04 20060101AFI20240927BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】簡便な操作で迅速に有機物又は微生物を検出する方法を提供すること。
【解決手段】検水中の有機物又は微生物を検出する方法であって、前記検水とαアルミナ粒子を混ぜて、検出用αアルミナ粒子を得る工程と、前記検出用αアルミナ粒子に蛍光色素を加えて、蛍光顕微鏡を用いて観察する工程と、を含む、方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
検水中の有機物又は微生物を検出する方法であって、
前記検水とαアルミナ粒子を混ぜて、検出用αアルミナ粒子を得る工程と、
前記検出用αアルミナ粒子に蛍光色素を加えて、蛍光顕微鏡を用いて観察する工程と、を含む、方法。
続きを表示（約 970 文字）【請求項２】
蛍光顕微鏡を用いて、前記検出用αアルミナ粒子が発する蛍光強度を測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
蛍光顕微鏡を用いて、前記検出用αアルミナ粒子が発する蛍光の色調を観察する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
洗浄による有機物又は微生物の除去具合を評価する方法であって、
前記有機物又は微生物が付着したαアルミナ粒子を含むインジケーターを用意する工程と、
洗浄前に、洗浄箇所の近傍に前記インジケーターを配置する工程と、
洗浄後に、前記インジケーターに蛍光色素を加えて、蛍光顕微鏡を用いて観察する工程と、
前記インジケーターが発する蛍光の強度又は色調に基づいて、前記有機物又は微生物が除去されたと評価する工程と、を含む、方法。
【請求項５】
前記インジケーターが発する蛍光強度が閾値以下であるとき、前記有機物又は微生物が除去されたと評価する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記蛍光色素がアクリジンオレンジ（ＡＯ）であり、前記インジケーターが発する蛍光の色調が緑色であるとき、前記有機物又は微生物が除去されたと評価する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
対象の洗浄方法であって、
対象の表面を拭った検体を水と混合して、検水を用意する工程と
請求項１～３のいずれか一項に記載の方法により、前記検水中の有機物又は微生物を検出する工程と、
前記有機物又は微生物が付着したαアルミナ粒子を含むインジケーターを用意する工程と、
洗浄前に、汚染されていると判定された表面の近傍に前記インジケーターを配置する工程と、
洗浄後に、インジケーターに蛍光色素を加えて、蛍光顕微鏡を用いて観察する工程と、
前記インジケーターが発する蛍光の強度又は色調に基づいて、前記有機物又は微生物が除去されたと評価する工程と、を含む、方法。
【請求項８】
前記有機物又は微生物が除去されたと評価された前記表面に対して、有機物又は微生物を検出する前記工程を再度行い、有機物又は微生物が検出されないことを確認する工程をさらに含む、請求項７に記載の方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物および微生物由来の有機物汚れの検出及び残留評価技術に関する。
続きを表示（約 2,400 文字）【背景技術】
【０００２】
近年、日常生活において、微生物を除去する方法が注目されている。特に、産業界では、点眼薬、注射剤等の無菌製剤を製造するラインにおいて使用する機器及び設備に微生物が付着していると、製剤内へのコンタミネーションを起こす虞があり、製品の品質低下を招くことがある。また、深海、宇宙等の極限環境における生命探査の現場においても、探査前に微生物又は微生物に由来する有機物が所持品に付着していると、その探査結果を検証する際のノイズとなり得る。このような場面で使用する機器、設備の清浄度を確認することは非常に重要である。
【０００３】
従来の洗浄プロセスの研究では、しばしば、有機物汚れを有する検体として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はペクチンを吸着させたアルミナ粒子やステンレス鋼粉末が使用されている。非特許文献１では、ＢＳＡで汚染されたアルミナ粒子をアルカリ洗浄する前にオゾンガスで前処理することにより、ＢＳＡが部分的に分解し、ＢＳＡの除去効果が向上することを報告している。非特許文献２では、ＢＳＡで汚染されたアルミナ粒子を次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）水溶液で洗浄する際、ｐＨを特定の範囲に調整することで、非解離型（ＨＯＣｌ）と解離型（ＯＣｌ
－
）の比率が次亜塩素酸ナトリウムの洗浄効果を向上させたことを報告している。非特許文献３では、ＢＳＡで汚染されたステンレス鋼粉末の洗浄効果は、熱処理により影響を受けることが報告されている。具体的には、ステンレス鋼粉末を熱処理すると、表面のヒドロキシル化度及び見かけの表面電荷密度（σ
ａｐｐ
）が顕著に低下し、ＢＳＡの吸着量が増加することが報告されている。また、非特許文献４では、Bacillus subtilisの芽胞に対する次亜塩素酸水溶液エアロゾルの殺芽胞効果を検討し、均一空気条件下で再現性のあるデータを取得できることを報告している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
Takehara, A. et al. Journal ofBioscience and Bioengineering, Vol.89, No.3, 267-270, 2000.
Urano, H. and Fukuzaki S. BiocontrolScience, 2005, Vol.10, Nos.1.2, 21-29.
Takahashi, K. et al. BiocontrolScience, 2006, Vol.11, No.2, 61-68.
Ishikawa, S. et al. BiocontrolScience, 2019, Vol.24, No.1, 57-65.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一般的に微生物の検出方法としては、平板法、直接計数法、マイクロコロニー法、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法が挙げられる。平板法は、検体から抽出した微生物を、栄養を含む寒天平板培地に塗布し、適温で培養してコロニーを形成させる方法であり、操作が煩雑であり、より長い時間を要し、解像度もあまり高くない。直接計数法は、検水中の微生物を蛍光色素で染色し、顕微鏡下で直接計数する方法であり、操作が簡単であるものの、細胞濃度が薄いと細胞を見つけるのが困難である。ＰＣＲ法及びＬＡＭＰ法は、検体中の微生物からＤＮＡを抽出し、特定のＤＮＡを増幅させて検出する方法であり、ＤＮＡ抽出作業が繁雑である。また、非特許文献１～３では、洗浄後のアルミナ粒子やステンレス鋼粉末をカラムクロマトグラフィーにより残存タンパク質を抽出して評価している。しかし、これらの方法では、微生物又は有機物汚れの検出に分析機器が必要であり、その場で迅速に評価することは困難である。
【０００６】
そこで、本発明は、簡便な操作で迅速に有機物又は微生物を検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、検水中の有機物又は微生物を検出する方法であって、上記検水とαアルミナ粒子を混ぜて、検出用αアルミナ粒子を得る工程と、上記検出用αアルミナ粒子に蛍光色素を加えて、蛍光顕微鏡を用いて観察する工程と、を含む、方法を提供する。
【０００８】
蛍光顕微鏡を用いて観察する際、検出用αアルミナ粒子が発する蛍光強度を測定してもよく、蛍光の色調を観察してもよい。これらの方法により、検水中の有機物又は微生物を検出することができる。有機物は、微生物由来の有機物であり得る。
【０００９】
また、本発明は、洗浄による有機物又は微生物の除去具合を評価する方法であって、上記有機物又は微生物が付着したαアルミナ粒子を含むインジケーターを用意する工程と、洗浄前に、洗浄箇所の近傍にインジケーターを配置する工程と、洗浄後に、上記インジケーターに蛍光色素を加えて、蛍光顕微鏡を用いて観察する工程と、上記インジケーターが発する蛍光の強度又は色調に基づいて、上記有機物又は微生物が除去されたと評価する工程と、を含む、方法を提供する。
【００１０】
インジケーターに含まれるαアルミナ粒子に蛍光色素を組み合わせると、αアルミナ粒子は蛍光を発する。αアルミナ粒子の表面に吸着された有機物又は微生物の量が多いほど、αアルミナ粒子が発する蛍光の強度が高くなる傾向がある。そのため、インジケーターが発する蛍光強度が閾値以下であるとき、除去対象である有機物又は微生物が除去されたと評価することができる。
（【００１１】以降は省略されています）

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