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公開番号2024130269
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-09-30
出願番号2023039897
出願日2023-03-14
発明の名称感染性の硝子体疾患の検出方法
出願人国立大学法人大阪大学
代理人弁理士法人R&C
主分類C12Q 1/6869 20180101AFI20240920BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】硝子体組織中の微生物叢に着目した、硝子体疾患の病態生理を迅速かつ正確に解明できる技術の構築。
【解決手段】以下の工程、(a)被験者の硝子体組織から採取した硝子体組織検体中の微生物叢に含まれる微生物クラスターの遺伝子の塩基配列情報を取得する工程と、(b)得られた遺伝子配列情報に基づいて、前記微生物叢に含まれる微生物クラスターを同定し、同定された微生物クラスターそれぞれの相対的占有率を算出することにより前記微生物叢の構成を解析する工程、(c)前記微生物叢が、最も相対的占有率の高い微生物クラスターが、2番目に相対的占有率の高い微生物クラスターの2倍以上の相対的占有率で含まれるとの第1基準、を含む判断基準を満たすか否かを判定し、前記判断基準を満たす場合に、前記被験者は感染性の硝子体疾患であるとして検出する工程、とを有する、感染性の硝子体疾患の検出方法。
【選択図】図4
特許請求の範囲【請求項１】
感染性の硝子体疾患の検出方法であって、
以下の工程、
（ａ）被験者の硝子体組織から採取した硝子体組織検体中の微生物叢に含まれる微生物クラスターの遺伝子の塩基配列情報を取得する工程と、
（ｂ）得られた遺伝子配列情報に基づいて、前記微生物叢に含まれる微生物クラスターを同定し、同定された微生物クラスターそれぞれの相対的占有率を算出することにより前記微生物叢の構成を解析する工程と、
（ｃ）前記微生物叢が、最も相対的占有率の高い微生物クラスターが、２番目に相対的占有率の高い微生物クラスターの２倍以上の相対的占有率で含まれるとの第１基準、
を含む判断基準を満たすか否かを判定し、前記判断基準を満たす場合に、前記被験者は感染性の硝子体疾患であるとして検出する工程と、を有する、感染性の硝子体疾患の検出方法。
続きを表示（約 620 文字）【請求項２】
前記工程（ｃ）の前記判断基準が、前記最も相対的占有率の高い微生物クラスターの相対的占有率が２５％以上であるとの第２基準を含む、請求項１に記載の感染性の硝子体疾患の検出方法。
【請求項３】
前記工程（ｂ）の前記微生物叢の構成を解析する工程が、前記同定された微生物クラスターの総数を算出することを含み、かつ、
前記工程（ｃ）の前記判断基準が、前記同定された微生物クラスターの総数が３０以下であるとの第３基準を含む、請求項１又は２に記載の感染性の硝子体疾患の検出方法。
【請求項４】
前記工程（ｂ）の前記微生物叢の構成を解析する工程が、前記同定された微生物クラスターの総数を算出することを含み、かつ、
前記工程（ｃ）の判断基準が、相対的占有率が２％以上の微生物クラスターの数が１０以下であるとの第４基準を含む請求項１又は２に記載の感染性の硝子体疾患の検出方法。
【請求項５】
（ｄ）前記工程（ｃ）の後に、感染性の硝子体疾患であるとして検出された被験者において、前記最も相対的占有率の高い微生物クラスターを前記感染性の硝子体疾患の原因微生物として検出する工程、を含む請求項１又は２に記載の感染性の硝子体疾患の検出方法。
【請求項６】
前記塩基配列情報が、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列情報である、請求項１又は２に記載の感染性の硝子体疾患の検出方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染性の硝子体疾患の検出方法に関し、被験者から採取した硝子体組織検体の微生物叢の解析に基づく感染性の硝子体疾患の検出方法である。
続きを表示（約 3,000 文字）【背景技術】
【０００２】
感染症の原因微生物の検出同定は、感染症の確定診断、およびそれに続く抗生物質の選択等の治療方針の決定や感染対策に重要な役割を果たす。従来において、原因微生物の検査同定には、原因微生物を分離培養し検出同定する培養法やポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」と略する）等を利用して原因微生物の遺伝子から原因微生物を検出同定する遺伝子検出法等により行われてきた。しかし、培養法では、培養条件の設定が必要であり培養困難な微生物ではしばしば原因微生物が同定できない症例があった（非特許文献１～２参照）。また、遺伝子検出法においても原因微生物の遺伝子の配列情報が存在しないこと等に起因するプライマーやプローブの設計面での限界がある。そのため、感染症治療において原因微生物の検出同定が困難な症例が認められ、的確な治療や感染対策が難しい場合あった。
【０００３】
２０１０年にマイクロバイオームプロジェクトが開始され、人体の各組織におけるマイクロバイオームの同定が報告されてきた（非特許文献３参照）。かかるプロジェクトは、各組織に存在する微生物叢とその遺伝子配列情報等を解析し理解することにより、健康維持や疾患治療に応用するものである。そして、１６ＳｒＲＮＡ領域をターゲットとしたゲノムシークエンスを行うことで、検体中の微生物群の網羅的な同定が可能となっている（非特許文献４参照）。現在では、ショットガン解析を用いた種レベルでの分類学的な同定や、機能遺伝子解析等の多様な解析が可能となり、疾患発症に関与する微生物叢の解析が進められている。メタゲノム解析は微生物叢を網羅的に解析でき（非特許文献５参照）、また、解析技術の進歩に伴ってコストの削減がなされたことから、特に、微生物叢の同定方法として利用しやすい方法として周知されている。
【０００４】
微生物叢を構成する微生物には、細菌、真菌、ウイルス等が含まれるが、特に、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を用いた細菌叢の同定が進められてきた。近年、微生物叢の構成成分として細菌叢に加えて真菌叢の同定も可能となってきている。従来においては、真菌叢はそれ自体の同定が困難であり真菌叢に関する報告も少なかったが内部転写スペーサー（ＩｎｔｅｒｎａｌＴｒａｎｓｃｒｉｂｅｄＳｐａｃｅｒ：ＩＴＳ）領域を標的としてシークエンスを行うことにより真菌叢の同定も可能となった（非特許文献６参照）。全身疾患の発症への真菌叢の関与については、膵臓癌発症において真菌叢変化が癌促進因子となり、またアトピー性皮膚炎を代表とする表在性皮膚疾患ではマラセチア属真菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）が疾患バイオマーカーとなり得ることが報告されている（非特許文献７参照）。直近では、シークエンサーの進歩によりウイルス叢の同定も可能になりつつあることが報告されている（非特許文献８参照）。
【０００５】
メタゲノム解析等に用いられる次世代シークエンサーの最たるメリットは、上記した培養法では必須である培養工程を経ることなく、検体中に存在する微生物叢を網羅的に解析できることである。培養に際しては、細菌では数日間、真菌では１週間程度の培養日数が必要であり、迅速な原因微生物の同定を妨げる要因となっていた。特に、迅速な対策を要する感染性の眼疾患において迅速な原因微生物の同定は疾患予後を考えるうえでも重要な要素である。
【０００６】
現状、眼表面疾患では、シェーグレン症候群や角膜潰瘍において、眼結膜組織の微生物叢の解析を通じて、その病態と微生物叢の変化の関係が報告されている。また、アレルギー性結膜炎では、細菌叢および真菌叢の両方での変化（細菌叢ではＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｎｅｓ、真菌叢ではマラセチア属真菌の相対的占有率の変化）が疾患発症に関与すると報告されている。このように眼表面疾患と眼結膜組織の微生物叢の相関は、多数報告されてきている。一方、硝子体疾患ではその発症や病態生理と微生物叢との相関を検討した確たる報告は存在しなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
ＨｏｌｔＫＥ他著，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２０１５，１１２（２７），Ｅ３５７４～Ｅ３５８１
ＢｏｎｎｅｔＭ他著，ＮｅｗＭｉｃｒｏｂｅｓＮｅｗＩｎｆｅｃｔ，２０２０，３４，１００６２２
ＱｉｎＪｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１０，４６４（７２８５），ｐ５９－ｐ６５
ＣｏｓｔｅｌｌｏＥＫｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，３２６（５９６０），ｐ１６９４－ｐ１６９７
ＸｉＨ他著，ＦｒｏｎｔＭｅｄ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）．２０２２，９，８４７１４３
ＭｏｔｏｏｋａＤｅｔａｌ．ＦｒｏｎｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１７，８，２３８
ＡｙｋｕｔＢｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ, ２０１９，５７４（７７７７），ｐ２６４－２６７
ＬｉａｎｇＧｅｔａｌ．ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０２１，１９（８），ｐ５１４－５２７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記した通り、従来において、硝子体疾患ではその発症や病態と微生物叢との相関に関する確たる報告はなかった。硝子体組織からの検体採取には硝子体手術を要し、しかも、ある程度、病期が進行した状態で手術が行われるため、解析のための硝子体組織検体自体が入手し難い状況であったことが要因の１つとして考えられる。しかも、硝子体組織において安定して微生物叢が存在しているのか否かについても十分な報告がないのが現状であった。しかし、網膜・硝子体疾患は、網膜剥離や糖尿病網膜症等の失明につながる疾患が多く含まれる。そのため、硝子体組織を解析し疾患の病態解明を行うことは、硝子体疾患の発症予防や有効な治療薬等の治療法の選択に重要である。そこで、本発明は、硝子体疾患の病態生理を迅速かつ正確に解明できる技術の構築を目的とし、特に、硝子体組織中の微生物叢と硝子体疾患の病態生理との相関に着目した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、硝子体組織にも微生物叢が存在し、かかる微生物叢を構成する微生物の遺伝子の塩基配列情報を解析することにより、硝子体疾患が微生物感染によるものであるのか否かを迅速に検出できる判断基準を確立し、感染性の硝子体疾患を迅速かつ正確に検出できるとの知見を得た。また、感染性の硝子体疾患である場合にはその原因微生物を迅速かつ正確に特定することができるとの知見をも得た。本発明者らは、これらの知見に基づき本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、以下の〔１〕～〔６〕の発明を提供する。〔１〕の発明単独で課題を解決できるが、〔２〕～〔６〕の発明の何れかと組み合わせても良い。
（【００１１】以降は省略されています）

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