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公開番号2024123352
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-09-12
出願番号2023030686
出願日2023-03-01
発明の名称創薬スクリーニング方法及び脊椎動物細胞への遺伝子導入方法
出願人個人
代理人個人
主分類C12N 15/85 20060101AFI20240905BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】ゲノムDNAプロモーターを用いた目的タンパク質の組織特異的な発現を、生きている脊椎動物の個体レベルで簡便に可視化し、かつ、ハイスループットで評価可能な創薬スクリーニングシステムを提供する。
【解決手段】本発明は、DNA構築物を脊椎動物細胞に導入する工程と、目的タンパク質の組織特異的な発現の程度を観察する工程とを含む創薬スクリーニング方法である。DNA構築物は、一対のTol2トランスポゾン由来の塩基配列の間に、目的タンパク質をコードする外来遺伝子断片を含む遺伝子断片が挿入され、外来遺伝子断片の配列が脊椎動物の所定細胞に組織特異的に発現する組織特異的プロモーター配列を有する。
【選択図】図7
特許請求の範囲【請求項１】
ＤＮＡ構築物を脊椎動物細胞に導入する工程と、
目的タンパク質の組織特異的な発現の程度を観察する工程を含み、
前記ＤＮＡ構築物は、一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列の間に、前記目的タンパク質をコードする外来遺伝子断片を含む遺伝子断片が挿入され、前記外来遺伝子断片の配列が脊椎動物の所定細胞に組織特異的に発現する組織特異的プロモーター配列を有する、創薬スクリーニング方法。
続きを表示（約 960 文字）【請求項２】
前記遺伝子断片は、前記外来遺伝子断片の下流に、蛍光タンパク質遺伝子、発光タンパク質遺伝子、活性酸素産生遺伝子及び薬剤耐性遺伝子から選択される選択マーカー遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の創薬スクリーニング方法。
【請求項３】
前記遺伝子断片は、前記外来遺伝子断片の下流に、酵母転写因子ＧＡＬ４をコードするＧＡＬ４遺伝子をさらに含み、
前記選択マーカー遺伝子は、前記ＧＡＬ４遺伝子の下流に配される、請求項２に記載の創薬スクリーニング方法。
【請求項４】
ゲノム編集法によって前記ＤＮＡ構築物を構築する工程をさらに含む、請求項１に記載の創薬スクリーニング方法。
【請求項５】
前記ゲノム編集法は、ＣＲＩＳＰＲを介した遺伝子編集、ＢａｓｅＥｄｉｔｏｒ（塩基エディター）を介した遺伝子編集、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰを介した遺伝子編集、及びＰｒｉｍｅｅｄｉｔｏｒから選択される１種以上を含む、請求項４に記載の創薬スクリーニング方法。
【請求項６】
前記ゲノム編集法は、ＣＲＩＳＰＲを介した遺伝子編集であり、
前記ＣＲＩＳＰＲを介した遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した遺伝子編集、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｎを介した遺伝子編集、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａを介した遺伝子編集から選択される１種以上を含む、請求項５に記載の創薬スクリーニング方法。
【請求項７】
前記外来遺伝子断片がアンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）をコードするＤＮＡ断片である、請求項１に記載の創薬スクリーニング方法。
【請求項８】
前記一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列のうち、５’側の塩基配列の長さが１８０ｂｐ以上である、請求項１に記載の創薬スクリーニング方法。
【請求項９】
前記一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列のうち、３’側の塩基配列の長さが１４０ｂｐ以上である、請求項１に記載の創薬スクリーニング方法。
【請求項１０】
前記外来遺伝子断片の長さが７００ｂｐ以上１６４ｋｂｐ以下である、請求項１に記載の創薬スクリーニング方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、創薬スクリーニング方法及び脊椎動物細胞への遺伝子導入方法に関する。
続きを表示（約 2,200 文字）【背景技術】
【０００２】
ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヒト細胞への感染は、ウイルス外膜のスパイクタンパク質（Ｓタンパク質）とヒト細胞表面に存在するＡＣＥ２（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅ２）受容体との結合が引き金となる。ＡＣＥ２受容体に結合したＳタンパク質は、タンパク質分解酵素であるＴＭＰＲＳＳ２により切断されて活性化され、ウイルス外膜と細胞膜との融合を促進することにより、ウイルスはヒト細胞へと侵入する。このようにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染はＡＣＥ２とＴＭＰＲＳＳ２を発現する細胞において起こるが、ＴＭＰＲＳＳ２は広汎な細胞に発現が見られており、ＡＣＥ２の発現が主にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染を規定している。
【０００３】
ヒトＡＣＥ２遺伝子は、小腸・十二指腸・大腸の腸上皮細胞や、腎臓、精巣、胆嚢、心臓などの一部の細胞に特に強く発現するが、一部の鼻粘膜上皮細胞や肺胞細胞にも発現している。ＣＯＶＩＤ－１９の主な症状である呼吸器系の症状はこの鼻粘膜上皮細胞や肺胞細胞への感染を通じて生じると考えられるが、下痢などの症状が出るケースもあり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はＡＣＥ２の発現を利用して種々の細胞に入り込み増殖し、その機能を撹乱するものと考えられている。
【０００４】
また、ＡＣＥ２は角膜で強く発現されていることも報告されており、眼がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の入り口になりうる可能性も提唱されている。小児では鼻粘膜上皮細胞におけるＡＣＥ２の発現が低いという報告もあり、このＡＣＥ２の低発現が小児での流行が抑制されている理由である可能性もある。
【０００５】
このように、ある特定の組織におけるＡＣＥ２の発現を調節することが可能であれば、感染リスクの低減、重症化の抑制につながるものと考えられる。
【０００６】
ここで、ＡＣＥ２の発現と機能についてマウスを用いた個体レベルでの研究が進められている（特許文献１／非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
Hongpeng Jia et al., ACE2 mouse models: a toolbox for cardiovascular and pulmonary research, Nature Communications 11, 5165 (2020)
Koga, et al., Transposable element in fish, Nature, 383, 30 (1996)
Kawakami, K., Shima, A., and Kawakami, Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage, N. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 11403-11408 (2000)
Kawakami, K. and Noda, T., Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells. Genetics 166, 895-899 (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
非特許文献１に記載の研究は、マウスＡＣＥ２プロモーターで行われたものであり、ヒトプロモーターを用いて行われたものではない。また、ＡＣＥ２の発現を、個体レベルで簡便に可視化し、かつ、ハイスループットで評価するシステムは存在しなかった。
【０００９】
本発明は、このような問題に鑑みてなされたものであり、ゲノムＤＮＡプロモーターを用いた目的タンパク質の組織特異的な発現を、生きている脊椎動物の個体レベルで簡便に可視化し、かつ、ハイスループットで評価可能なシステムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
メダカ（Ｏｒｙｚｉａｓｌａｔｉｐｅｓ）は、東アジアに生息する魚である。メダカのｉ遺伝子座の変異は、メラニン欠乏症及び赤目を生じさせる。このｉ遺伝子座は、チロシナーゼの遺伝子をコードしていることが知られている。図１は、トランスポゾンの全体構造を示す。図１の太線部分がトランスポゾンを表し、網掛け部分が転移酵素遺伝子のエキソンを表し、矢印が転移酵素遺伝子の転写を表す。白抜き三角はトランスポゾン両端の繰り返し配列を表し、網掛け三角はトランスポゾンに隣接するゲノム上の繰り返し配列を表す。また、ＡＴＧは開始であり、ＴＡＧは終止コドンである。
（【００１１】以降は省略されています）

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