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公開番号2024109093
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-08-13
出願番号2024011624
出願日2024-01-30
発明の名称アセトバニロン変換酵素遺伝子及びそれを用いた有用物質生産
出願人国立大学法人弘前大学,国立大学法人長岡技術科学大学
代理人個人
主分類C12N 15/52 20060101AFI20240805BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】本発明の目的は、スフィンゴビウム・スピーシーズSYK-6株が保有するアセトバニロン変換酵素遺伝子群と比べて、より少ない遺伝子から構成され、かつ高効率でアセトバニロンからバニリン酸へ変換することができる遺伝子群及び該遺伝子群を保有する微生物、並びにこれらを利用したバニリン酸の製造方法を提供することにある。
【解決手段】上記目的はアセトバニロンをα-ヒドロキシアセトバニロンへ変換する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、acpA遺伝子及びacpB遺伝子並びにα-ヒドロキシアセトバニロンをバニリン酸へ変換する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、acpC遺伝子、これらの遺伝子を保有する微生物及び形質転換微生物、並びにそれらを利用した製造方法などにより解決される。
【選択図】図13B
特許請求の範囲【請求項１】
ａｃｐＡ
遺伝子及び
ａｃｐＢ
遺伝子が外来遺伝子として導入されており、かつ該導入された遺伝子を発現する、形質転換微生物。
続きを表示（約 2,100 文字）【請求項２】
前記形質転換微生物は、宿主微生物がシュードモナス・スピーシーズ（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｐ．）ＮＧＣ７株（受託番号：ＮＩＴＥＢＰ－０３０４３）である、請求項１に記載の形質転換微生物。
【請求項３】
アセトバニロンを、
ａｃｐＡ
遺伝子及び
ａｃｐＢ
遺伝子の発現産物に作用させることにより、又は請求項１若しくは２に記載の形質転換微生物に作用させることにより、α－ヒドロキシアセトバニロンを得る工程
を含む、α－ヒドロキシアセトバニロンの製造方法。
【請求項４】
ａｃｐＡ
遺伝子、
ａｃｐＢ
遺伝子及び
ａｃｐＣ
遺伝子が外来遺伝子として導入されており、かつ該導入された遺伝子を発現する、形質転換微生物。
【請求項５】
前記形質転換微生物は、宿主微生物が染色体上にあるバニレート
Ｏ
－デメチラーゼ遺伝子を欠失しているシュードモナス・スピーシーズ（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｐ．）ＮＧＣ７株（受託番号：ＮＩＴＥＢＰ－０３０４３）の形質転換微生物である、請求項４に記載の形質転換微生物。
【請求項６】
アセトバニロンを、
ａｃｐＡ
遺伝子、
ａｃｐＢ
遺伝子及び
ａｃｐＣ
遺伝子の発現産物に作用させることにより、又は請求項４若しくは５に記載の形質転換微生物に作用させることにより、バニリン酸を得る工程
を含む、バニリン酸の製造方法。
【請求項７】
前記形質転換微生物は、宿主微生物が染色体上にある
ｐｏｂＡ
遺伝子を欠失しているシュードモナス・スピーシーズ（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｐ．）ＮＧＣ７株（受託番号：ＮＩＴＥＢＰ－０３０４３）の形質転換微生物である、請求項４に記載の形質転換微生物。
【請求項８】
４’－ヒドロキシアセトフェノンを、
ａｃｐＡ
遺伝子、
ａｃｐＢ
遺伝子及び
ａｃｐＣ
遺伝子の発現産物に作用させることにより、又は請求項７に記載の形質転換微生物に作用させることにより、４－ヒドロキシ安息香酸を得る工程
を含む、４－ヒドロキシ安息香酸の製造方法。
【請求項９】
下記（１）～（４）のいずれかのヌクレオチド配列であって、アセトバニロンをα－ヒドロキシアセトバニロンへ変換する反応を触媒する活性を有する、及び／又は４’－ヒドロキシアセトフェノンを２，４’－ジヒドロキシアセトフェノンへ変換する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、
ａｃｐＡ
遺伝子。
（１）配列表の配列番号１又は４に記載のヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ該配列番号１又は４に記載のヌクレオチド配列において、塩基数１００個からなる一単位あたり、１個～１０個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有するヌクレオチド配列
（２）配列番号１又は４に記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子と８０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列
（３）配列番号５０に記載のアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
（４）配列番号５０に記載のアミノ酸配列において、アミノ酸数１００個からなる一単位あたり、１個～１０個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
【請求項１０】
下記（１）～（４）のいずれかのヌクレオチド配列であって、アセトバニロンをα－ヒドロキシアセトバニロンへ変換する反応を触媒する活性を有する、及び／又は４’－ヒドロキシアセトフェノンを２，４’－ジヒドロキシアセトフェノンへ変換する反応を触媒する活性を有する酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、
ａｃｐＢ
遺伝子。
（１）配列表の配列番号２又は５に記載のヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ該配列番号２又は５に記載のヌクレオチド配列において、塩基数１００個からなる一単位あたり、１個～１０個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有するヌクレオチド配列
（２）配列番号２又は５に記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子と８０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列
（３）配列番号５１に記載のアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
（４）配列番号５１に記載のアミノ酸配列において、アミノ酸数１００個からなる一単位あたり、１個～１０個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、アセトバニロンからバニリン酸中間体を経てバニリン酸へ変換する反応を触媒するアセトバニロン変換酵素及びそれを用いたバニリン酸等の有用物質の生産系に関する。
続きを表示（約 2,700 文字）【背景技術】
【０００２】
カーボンニュートラル社会の実現から、石油原料に代えて非可食バイオマスから機能性材料を製造することが求められている。その中で、非可食バイオマスを原料とした、セルロース誘導体及び脂肪族ポリマー原料の開発が進められている。しかし、これまでに、剛性、耐熱性などが満足できるポリマーはほとんど知られていない。
【０００３】
非可食バイオマスの一種にリグニンがある。リグニンは植物の維管束細胞壁成分として存在する無定形高分子物質であって、フェニルプロパン系の構成単位が複雑に縮合したものであり、メトキシ基を含有することが化学構造上の大きな特徴になっている。リグニンは木質化した植物細胞を相互に膠着し、組織を強化する働きをしており、木材中に約１８％～３６％、草本中には約１５％～２５％存在する。そこで、木材を有効利用するために、リグニンを分解し、有用化合物を得ようとする試みがなされている。木材などのバイオマスに由来するリグニンには、
ｐ
－ヒドロキシフェニルリグニン（Ｈ型リグニン）、グアイアシルリグニン（Ｇ型リグニン）及びシリンギルリグニン（Ｓ型リグニン）の３種があることが知られている。
【０００４】
リグニンを分解して得られる化合物の中には、分子内に芳香環を有するモノマーとして使用できるものがある。このような芳香族モノマーを原料とするポリマーは、剛性、耐熱性などの機能性が優れたものになり得る。
【０００５】
リグニン由来の芳香族モノマーの候補物質の一つとして、バニリン酸がある。バニリン酸を重合してなるポリマーは融点が非常に高いという特徴がある。例えば、バニリン酸を修飾等して得たモノマーを原料として得られる高機能性ポリマーは、融点が高く、機能性が高いことが知られている。しかし、リグニンを分解してもバニリン酸をほとんど得ることができない。
【０００６】
リグニンを分解して得られる化合物の中に、アセトバニロンがある。アセトバニロンはリグニンの酸化分解によって生成する主要な芳香族単量体である。針葉樹、広葉樹、草本によらずに、いずれの植物系バイオマスからもアセトバニロンは生成する。例えば、工業レベルで行われている木材パルプ製造工程であるクラフト蒸解などの廃液（黒液）にもアセトバニロンは含まれている。そこで、アセトバニロンをバニリン酸へ変換することができれば、リグニンからのバニリン酸生産においてバニリン酸収率の向上や目的生産物の純度向上に繋がる。
【０００７】
例えば、アセトバニロンを資化する能力を有する微生物又はその酵素を用いれば、微生物学的又は生化学的にアセトバニロンをバニリン酸へ変換できる可能性がある。これまでに知られているアセトバニロン資化性の微生物としては、スフィンゴビウム・スピーシーズ（
Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ
ｓｐ．）ＳＹＫ－６株（例えば、非特許文献１及び２）、ロドコッカス・ロドクラウス（
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ
ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ
）ＧＤ０１株（例えば、非特許文献３）、ロドコッカス・ロドクラウス（
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ
ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ
）ＧＤ０２株（例えば、非特許文献３及び４）及びアルスロバクター・スピーシーズ（
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ
ｓｐ．）ＴＧＪ４株（例えば、非特許文献５）がある。しかし、アセトバニロンの変換に関わる酵素メカニズムの詳細が明らかにされているのはスフィンゴビウム・スピーシーズＳＹＫ－６株（以下、ＳＹＫ－６株ともよぶ。）とロドコッカス・ロドクラウスＧＤ０２株（以下、ＧＤ０２株ともよぶ。）のみである。
【０００８】
ＳＹＫ－６株は、
ａｃｖＡ
遺伝子、
ａｃｖＢ
遺伝子、
ａｃｖＣ
遺伝子、
ａｃｖＤ
遺伝子、
ａｃｖＥ
遺伝子及び
ａｃｖＦ
遺伝子の６遺伝子によりコードされる酵素システムにより、アセトバニロン及びアセトシリンゴンをそれぞれｖａｎｉｌｌｏｙｌａｃｅｔｉｃａｃｉｄ及び３－（４－ｈｙｄｒｏｘｙ－３，５－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－３－ｏｘｏｐｒｏｐａｎｏｉｃａｃｉｄへカルボキシル化することが知られている（例えば、非特許文献１）。また、ＳＹＫ－６株は、
ｖｃｅＡ
遺伝子及び
ｖｃｅＢ
遺伝子の２遺伝子によりコードされる酵素システムにより、ｖａｎｉｌｌｏｙｌａｃｅｔｉｃａｃｉｄ及び３－（４－ｈｙｄｒｏｘｙ－３，５－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－３－ｏｘｏｐｒｏｐａｎｏｉｃａｃｉｄをそれぞれバニリン酸及びシリンガ酸へ変換することができる（例えば、非特許文献２）。したがって、ＳＹＫ－６株は、上記の合計８遺伝子からなるアセトバニロン変換酵素遺伝子群によりコードされる酵素システムにより、アセトバニロンからバニリン酸を生産できる。
【０００９】
ＳＹＫ－６株の上記８遺伝子を他の宿主微生物へ導入することにより、ＳＹＫ－６株以外の微生物でアセトバニロンからバニリン酸を合成し得る。そのような宿主微生物として、シュードモナス・スピーシーズ（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｐ．）ＮＧＣ７株（寄託番号：ＮＩＴＥＢＰ－０３０４３；以下、ＮＧＣ７株ともよぶ。）が挙げられる（例えば、特許文献１）。ＮＧＣ７株は、リグニン由来の芳香族化合物である
ｐ
－ヒドロキシ安息香酸及びシリンガ酸を分解することができる。また、ＮＧＣ７株は、バニレート
Ｏ
－デメチラーゼ遺伝子を保有することにより、バニリン酸を分解することができる。したがって、ＮＧＣ７株を用いてバニリン酸を生産するには、染色体上にあるバニレート
Ｏ
－デメチラーゼ遺伝子を不活化する必要がある。
【００１０】
そこで、本発明者らは、染色体上にあるバニレート
Ｏ
－デメチラーゼ遺伝子を不活化したＮＧＣ７株にＳＹＫ－６株の上記８遺伝子を導入し、得られた形質転換微生物によりアセトバニロンからバニリン酸を生産することを試みた（例えば、特許文献２を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
（【００１１】以降は省略されています）

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