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公開番号2024079806
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-06-11
出願番号2024052940,2019141009
出願日2024-03-28,2019-07-31
発明の名称γδ型T細胞への遺伝子導入方法
出願人国立大学法人三重大学,国立大学法人長崎大学
代理人弁理士法人謝国際特許商標事務所
主分類C12N 5/10 20060101AFI20240604BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】γδ型T細胞を高純度で大量に調製し、得られたγδ型T細胞に、TCRまたはCARをコードする外来遺伝子を効率よく導入して、機能的なTCRまたはCARを発現させたγδ型T細胞集団を製造する方法を提供する。
【解決手段】本発明は、γδ型T細胞をビスホスホン酸エステル誘導体で刺激後、IL-7およびIL-15の存在下で培養し、続いて遺伝子導入することにより、外来遺伝子が導入されたγδ型T細胞を、高い効率で高純度に製造する方法を提供する。外来遺伝子としてT細胞受容体(TCR)またはキメラ抗原受容体(CAR)を導入した場合、TCRおよびCARが機能的に発現したγδ型T細胞を得ることができる。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
導入遺伝子を発現するγδ型Ｔ細胞集団を製造する方法であって、
（工程１）γδ型Ｔ細胞を、２－（チアゾール－２－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネート、２－（３－ブロモピリジン－２－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネート、２－（５－フルオロピリジン－２－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネート、２－（ピリミジン－２－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネート、２－（７－アザインドール－１－イル）エチリデン－１，１－ビスホスホネート、２－（５－メチルチアゾール－２－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネート、２－（４－フェニルチアゾール－２－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネートおよび２－（ピリミジン－４－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネートのテトラキスピバロイルオキシメチルエステル誘導体ならびにそれらの薬学的に許容される塩からなる群より選ばれる１つ以上の化合物の存在下で培養する工程、
（工程２）工程１で培養したγδ型Ｔ細胞を、IL-7およびIL-15の存在下で培養する工程、および、
（工程３）工程２で培養したγδ型Ｔ細胞に遺伝子を導入する工程、
を含み、
前記遺伝子が、Ｔ細胞受容体（TCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）をコードする遺伝子であり、
前記Ｔ細胞受容体（TCR）が、NY-ESO-1p157-165／HLA-A2複合体特異的TCR、HTLV-1p40Taxp11-19／HLA-A2複合体特異的TCR、HTLV-1p40Taxp301-309／HLA-A24複合体特異的TCRおよびMAGE-A4p143-151／HLA-A24複合体特異的TCRからなる群より選ばれ、
前記キメラ抗原受容体（CAR）が、MAGE-A4p230-239／HLA-A2複合体特異的CAR、CEA特異的CAR、GD2特異的CARおよびCD19特異的CARからなる群より選ばれる、
方法。
続きを表示（約 990 文字）【請求項２】
導入遺伝子を発現するγδ型Ｔ細胞集団を製造する方法であって、
（工程１）γδ型Ｔ細胞を、テトラキスピバロイルオキシメチル２－（チアゾール－２－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネートまたはその薬学的に許容される塩の存在下で培養する工程、
（工程２）工程１で培養したγδ型Ｔ細胞を、IL-7およびIL-15の存在下で培養する工程、および、
（工程３）工程２で培養したγδ型Ｔ細胞に遺伝子を導入する工程、
を含む、方法。
【請求項３】
工程１におけるテトラキスピバロイルオキシメチル２－（チアゾール－２－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネートまたはその薬学的に許容される塩の濃度が0.01～1μMである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記γδ型Ｔ細胞が、哺乳動物に由来する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳動物が、がん患者または非がん患者である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記がんが、乳がん、肺がん、肝がん、口腔がん、上咽頭がん、頭頸部がん、胃がん、食道がん、大腸がん、皮膚がん、悪性黒色腫、腎がん、膵がん、脳腫瘍、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、膀胱がん、滑膜肉腫、脂肪肉腫、白血病、悪性リンパ腫および多発性骨髄腫からなる群より選ばれる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程３における遺伝子を導入する工程が、DNAベクターまたはRNAベクターを用いることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
工程３における遺伝子を導入する工程が、プラスミドベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスベクターからなる群より選ばれるベクターを用いることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
工程３における遺伝子を導入する工程が、レトロウイルスベクターを用いることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１～９のいずれか１項に記載の方法により得られた遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、外来遺伝子が導入されたγδ型Ｔ細胞を、高い効率で高純度に製造する方法に関する。
続きを表示（約 6,200 文字）【背景技術】
【０００２】
近年、がんに対する治療方法として、がん患者に対して、Ｔ細胞受容体（T cell receptor：TCR）またはキメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor：CAR）をコードする外来遺伝子を導入し、新たにがん抗原特異性を付与したＴ細胞を移入するT細胞輸注療法が注目されている。実際に、がん抗原であるMAGE-A4を認識するTCR遺伝子を導入し、このTCRを発現させたTCR遺伝子改変T細胞を、食道がん患者に投与する臨床試験が行われている（非特許文献１）。また、リガンド結合ドメインに、CD19に結合する一本鎖抗体（single chain variable fragment：scFv）を組み込んだCAR遺伝子を導入し、このCAR遺伝子を発現させたCAR遺伝子改変T細胞を、再発性・難治性急性リンパ性白血病患者に投与する臨床試験が行われている（非特許文献２）。
【０００３】
外来遺伝子を導入する標的となる細胞として、一般的にαβ型TCRを有するＴ細胞（αβ型Ｔ細胞）が使用されてきた。その理由は次の通りである。すなわち、外来遺伝子を導入するためには主にウイルスベクターが使用されるが、その際に、通常では標的細胞を増殖刺激することが必要である。そして、標的細胞としてαβ型Ｔ細胞を使用して遺伝子導入する場合には、抗CD3抗体および抗CD28抗体を用いることにより、容易に標的細胞の増殖刺激を行うことができるためである。
【０００４】
γδ型TCRを有するＴ細胞（γδ型Ｔ細胞）は、従来からウイルス感染細胞やがん細胞を傷害することが示されており、抗原特異性を付与したγδ型Ｔ細胞を患者に輸注する治療法は、αβ型Ｔ細胞を使用する場合よりも効果が高いことが期待されており、実際にγδ型T細胞輸注療法が試みられている（非特許文献３）。しかしながら、γδ型T細胞の細胞機能などの細胞学的特性の解析は十分ではない。その理由として、γδ型Ｔ細胞の存在量が末梢血Ｔ細胞の約5％と少量であり（非特許文献４）、細胞の解析に必要な細胞数を確保することが困難であることが挙げられている。γδ型Ｔ細胞は、αβ型Ｔ細胞とは異なり、抗CD3抗体および抗CD28抗体では十分に増殖させることができない。そのため、骨吸収抑制剤として使用されるビスホスホン酸誘導体であるゾレドロン酸（zoledronate）およびインターロイキン-２（IL-2）を用いて、γδ型Ｔ細胞を増殖させることが試みられてきた（非特許文献５および６）。しかしながら、ゾレドロン酸およびIL-2を用いた場合であっても、拡大培養されて得られるγδ型Ｔ細胞の純度が低いことが問題点であった。
【０００５】
ヒト末梢血から得られた単核球を、ビスホスホン酸エステル誘導体であるテトラキスピバロイルオキシメチル２－（チアゾール－２－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネートの存在下で培養し、そこへさらにIL-2を添加することにより、γδ型Ｔ細胞を高純度で増殖させる方法が報告されている（特許文献１および非特許文献７）。一方で、γδ型Ｔ細胞輸注療法を効果的に行うためには、高純度のγδ型Ｔ細胞を大量に調製し、同時に、得られたγδ型Ｔ細胞に、TCRまたはCARをコードする外来遺伝子を効率よく導入することが望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
WO2016/098904
【非特許文献】
【０００７】
Kageyama S, et al. Adoptive transfer of MAGE-A4 T-cell receptor gene-transduced lymphocytes in patients with recurrent esophageal cancer. Clin Cancer Res. 2015 May 15;21(10):2268-2277.
Maude SL, et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. N Engl J Med. 2014 Oct 16;371(16):1507-1517.
Kobayashi H, et al. Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using gamma-delta T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study. Cancer Immunol Immunother. 2007 Apr;56(4):469-476.
Carding SR and Egan PJ. Gammadelta T cells: functional plasticity and heterogeneity. Nat Rev Immunol. 2002 May;2(5):336-345.
Nicol AJ, et al. Clinical evaluation of autologous gamma delta T cell-based immunotherapy for metastatic solid tumours. Br J Cancer. 2011 Sep 6;105(6):778-786.
Kobayashi H, et al. Phase I/II study of adoptive transfer of γδ T cells in combination with zoledronic acid and IL-2 to patients with advanced renal cell carcinoma. Cancer Immunol Immunother. 2011 Aug;60(8):1075-1084.
Tanaka Y, et al. Expansion of human γδ T cells for adoptive immunotherapy using a bisphosphonate prodrug. Cancer Sci. 2018 Mar;109(3):587-599.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、γδ型Ｔ細胞を高純度で大量に調製し、得られたγδ型Ｔ細胞に、TCRまたはCARをコードする外来遺伝子を効率よく導入して、機能的なTCRまたはCARを発現させたγδ型Ｔ細胞集団を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、以下の発明により達成される。
（１）導入遺伝子を発現するγδ型Ｔ細胞集団を製造する方法であって、
（工程１）γδ型Ｔ細胞を、２－（チアゾール－２－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネート、２－（３－ブロモピリジン－２－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネート、２－（５－フルオロピリジン－２－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネート、２－（ピリミジン－２－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネート、２－（７－アザインドール－１－イル）エチリデン－１，１－ビスホスホネート、２－（５－メチルチアゾール－２－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネート、２－（４－フェニルチアゾール－２－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネートおよび２－（ピリミジン－４－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネートのテトラキスピバロイルオキシメチルエステル誘導体ならびにそれらの薬学的に許容される塩からなる群より選ばれる１つ以上の化合物の存在下で培養する工程、
（工程２）工程１で培養したγδ型Ｔ細胞を、IL-7およびIL-15の存在下で培養する工程、および、
（工程３）工程２で培養したγδ型Ｔ細胞に遺伝子を導入する工程、
を含む、方法。
（２）導入遺伝子を発現するγδ型Ｔ細胞集団を製造する方法であって、
（工程１）γδ型Ｔ細胞を、テトラキスピバロイルオキシメチル２－（チアゾール－２－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネートまたはその薬学的に許容される塩の存在下で培養する工程、
（工程２）工程１で培養したγδ型Ｔ細胞を、IL-7およびIL-15の存在下で培養する工程、および、
（工程３）工程２で培養したγδ型Ｔ細胞に遺伝子を導入する工程、
を含む、方法。
（３）工程１におけるテトラキスピバロイルオキシメチル２－（チアゾール－２－イルアミノ）エチリデン－１，１－ビスホスホネートまたはその薬学的に許容される塩の濃度が0.01～1μMである、（２）に記載の方法。
（４）前記γδ型Ｔ細胞が、哺乳動物に由来する、（１）または（２）に記載の方法。
（５）前記哺乳動物が、がん患者または非がん患者である、（４）に記載の方法。
（６）前記がんが、乳がん、肺がん、肝がん、口腔がん、上咽頭がん、頭頸部がん、胃がん、食道がん、大腸がん、皮膚がん、悪性黒色腫、腎がん、膵がん、胆管がん、脳腫瘍、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、膀胱がん、滑膜肉腫、白血病、悪性リンパ腫および多発性骨髄腫からなる群より選ばれる、（５）に記載の方法。
（７）工程３における遺伝子を導入する工程が、DNAベクターまたはRNAベクターを用いることを特徴とする、（１）または（２）に記載の方法。
（８）工程３における遺伝子を導入する工程が、プラスミドベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスベクターからなる群より選ばれるベクターを用いることを特徴とする、（１）または（２）に記載の方法。
（９）工程３における遺伝子を導入する工程が、レトロウイルスベクターを用いることを特徴とする、（１）または（２）に記載の方法。
（１０）前記遺伝子が、Ｔ細胞受容体（TCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）をコードする遺伝子である、（１）または（２）に記載の方法。
（１１）前記Ｔ細胞受容体（TCR）が、NY-ESO-1
p157-165
／HLA-A2複合体特異的TCR、HTLV-1p40Tax
p11-19
／HLA-A2複合体特異的TCR、HTLV-1p40Tax
p301-309
／HLA-A24複合体特異的TCRおよびMAGE-A4
p143-151
／HLA-A24複合体特異的TCRからなる群より選ばれる、（（１０）に記載の方法。
（１２）前記キメラ抗原受容体（CAR）が、MAGE-A4
p230-239
／HLA-A2複合体特異的CAR、CEA特異的CAR、GD2特異的CARおよびCD19特異的CARからなる群より選ばれる、（１０）に記載の方法。
（１３）（１）～（１２）のいずれかに記載の方法により得られる遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
（１４）（１３）に記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団と薬学的に許容される添加剤とを含有する医薬組成物。
（１５）自家的または同種的な移植によりがん治療対象を処置するための、（１４）に記載の医薬組成物。
（１６）下記の特徴を有する、遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
（ｉ）NY-ESO-1
p157-165
／HLA-A2複合体、HTLV-1p40Tax
p11-19
／HLA-A2複合体、HTLV-1p40Tax
p301-309
／HLA-A24複合体またはMAGE-A4
p143-151
／HLA-A24複合体を特異的に認識するTCRを発現する、
（ｉｉ）CD3およびNKG2Dが陽性である、
（ｉｉｉ）IFN-γおよびTNFαを含むサイトカインおよびケモカインを産生する、ならびに
（ｉｖ）細胞傷害活性を有する。
（１７）下記の特徴を有する、遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
（ｉ）MAGE-A4
p230-239
／HLA-A2複合体、CEA、GD2またはCD19を特異的に認識するCARを発現する、
（ｉｉ）CD3およびNKG2Dが陽性である、
（ｉｉｉ）IFN-γおよびTNFαを含むサイトカインおよびケモカインを産生する、ならびに
（ｉｖ）細胞傷害活性を有する。
（１８）前記遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団が、DNAベクターまたはRNAベクターを用いて遺伝子が導入されたγδ型Ｔ細胞集団であることを特徴とする、（１６）または（１７）に記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
（１９）前記遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団が、プラスミドベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスベクターからなる群より選ばれるベクターを用いて遺伝子が導入されたγδ型Ｔ細胞集団であることを特徴とする、（１６）または（１７）に記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
（２０）前記遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団が、レトロウイルスベクターを用いて遺伝子が導入されたγδ型Ｔ細胞集団であることを特徴とする、（１６）または（１７）に記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
（２１）前記遺伝子が、Ｔ細胞受容体（TCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）をコードする遺伝子である、（１６）または（１７）に記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
（２２）（１６）～（２１）のいずれかに記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団を含む医薬組成物。
（２３）（１６）～（２１）のいずれかに記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団を含む細胞製剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、末梢血から得られた単核球をビスホスホン酸エステル誘導体で刺激後、IL-7およびIL-15の存在下で培養することにより、IL-2の存在下で培養する従来法に比較して、多数の高純度のγδ型Ｔ細胞を製造することが可能である。さらに、ビスホスホン酸エステル誘導体の刺激により増殖するγδ型Ｔ細胞に対し、例えばレトロウイルスベクターを用いることにより、効率よく外来遺伝子を導入することができる。外来遺伝子としてTCRおよびCARを導入した場合、TCRおよびCARが機能的に発現したγδ型Ｔ細胞を得ることができる。
（【００１１】以降は省略されています）

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