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公開番号2024056901
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-04-23
出願番号2024021262,2022179759
出願日2024-02-15,2018-03-27
発明の名称未分化維持培地添加剤
出願人味の素株式会社,個人
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 1/00 20060101AFI20240416BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】多能性幹細胞を、未分化状態を維持しながら効率的に増殖するための培地、及び当該培地を用いた多能性幹細胞の増殖方法を提供する。
【解決手段】L‐トリプトファン、又はL‐キヌレニン、キヌレン酸若しくはL‐トリプトファン、及びアミノ酸がペプチド結合した、ジペプチドから選択されるL‐トリプトファン誘導体を176μM以上の濃度で含む、ヒト多能性幹細胞の増殖を促進するための、無血清培地添加剤を提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
Ｌ‐トリプトファン、又はＬ‐キヌレニン、キヌレン酸若しくはＬ‐トリプトファン及びアミノ酸がペプチド結合したジペプチドから選択されるＬ‐トリプトファン誘導体を含む、ヒト多能性幹細胞の増殖を促進するための無血清培地添加剤。
続きを表示（約 510 文字）【請求項２】
Ｌ‐トリプトファン誘導体が、Ｌ‐トリプトファンとアミノ酸がペプチド結合したジペプチドである、請求項１記載の培地添加剤。
【請求項３】
ジペプチドが、Ｌ‐アラニル‐Ｌ‐トリプトファンである、請求項２記載の培地添加剤。
【請求項４】
培地添加剤が、ヒト多能性幹細胞の増殖を未分化状態を維持したまま促進するための培地添加剤である、請求項１～３のいずれか一項に記載の無血清培地添加剤。
【請求項５】
Ｌ－トリプトファン又はＬ－トリプトファン誘導体を培地中１７６μＭ以上の濃度となるように含むための、請求項１～３のいずれか一項に記載の無血清培地添加剤。
【請求項６】
Ｌ－トリプトファンを培地中１７６μＭ以上の濃度となるように含むための、Ｌ‐トリプトファンを含む、ヒト多能性幹細胞の増殖を促進するための無血清培地添加剤。
【請求項７】
Ｌ‐トリプトファン、又はＬ‐キヌレニン、キヌレン酸若しくはＬ‐トリプトファン及びアミノ酸がペプチド結合したジペプチドから選択されるＬ‐トリプトファン誘導体を含む、ヒト多能性幹細胞の未分化維持剤。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、未分化状態を維持しながら多能性幹細胞を効率的に増殖するための培地、及び当該培地を用いた多能性幹細胞の増殖方法等に関する。
続きを表示（約 3,000 文字）【背景技術】
【０００２】
ＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ）や誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ：ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ）などの多能性幹細胞は、その優れた増殖性や多分化能から、再生医療等での使用が期待されている。特にｉＰＳ細胞は、作製・入手が比較的容易であること、作製に際しての倫理的制約が少ないこと、さらには移植の際の拒絶反応の観点から、非常に優れた再生医療の材料と目されている。
【０００３】
多能性幹細胞を用いて再生医療を行う場合、疾患の治療や治療法の開発研究に、多量の多能性幹細胞が必要となる。このため、多量の多能性幹細胞の供給を可能とするような、多能性幹細胞培養方法を開発及び改良することが重要となる。中でも、要となるのが培地の改良である。多量の細胞を培養するためには、多量の培地が必要となる。例えば、１０
６
個のｉＰＳ細胞を培養して１０
１０
程度の心筋細胞を作製し、患者一人に移植する場合、一人の患者あたり１００リットルもの培地が必要となり、培地にかかる費用は少なく見積もってもおよそ１００，０００ドルに達する。培地にかかる費用を抑える方法の１つは、単位培地体積あたりの培養することが可能な細胞数を増やすことである。つまり、より高効率かつ低コストの効果的な多能性幹細胞培養用培地のニーズが存在する。
【０００４】
通常、培地には必須アミノ酸が添加されている。例えば、幹細胞培養用培地であるｍＴｅＳＲ１培地（非特許文献１、２、３）やＥｓｓｅｎｔｉａｌ－８培地（非特許文献４）は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２培地を基礎培地とし、ｂＦＧＦやインスリン等のいくつかの因子を加えたものである。このＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中のアミノ酸の含有量は、血液中の遊離アミノ酸量をもとに設定されており、９．０２００ｍｇ／ＬのＬ‐トリプトファンが含まれている。これまで多くの培地が開発されてきたが、培地中のアミノ酸組成についてはほとんど改良されてこなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
特開２００４－１３５６７２号公報
特開２００７－２２８８１５号公報
ＵＳ２０１０/０３１７１０４Ａ１
ＷＯ２０１１/１００２８６Ａ２
【非特許文献】
【０００６】
ＬｕｄｗｉｇＴＥｅｔ．ａｌ．Ｎａｔ. Ｍｅｔｈｏｄｓ３（８）：６３７－４６；２００６
ＬｕｄｗｉｇＴＥｅｔ．ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２４（２）：１８５－７；２００６
Ｍａｓｔｅｒｓｅｔ．ａｌ．ＨｕｍａｎＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ．Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ：ＳｐｒｉｎｇｅｒＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；２００７
ＣｈｅｎＧｅｔ．ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ８（５）４２４－９；２０１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、多能性幹細胞を効率的に増殖することが可能な培地、及び当該培地を用いて多能性幹細胞を効率的に増殖する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成すべく、多能性幹細胞の培養過程における、培地中のアミノ酸量変化に注目した。その結果、多能性幹細胞の培養過程において培地中のＬ‐トリプトファン量が急速に減少し、培地に含まれる全アミノ酸中でＬ‐トリプトファンが最も早く枯渇することを見出した。ここで、必須アミノ酸であるＬ‐トリプトファンは他のアミノ酸に比べても培地処方濃度が低く（非特許文献１、２、３、４）、多能性幹細胞の大量増殖時にいち早く不足し、細胞増殖を制限する要因となることが予測された。そこで、本発明者らは、培地中のＬ‐トリプトファン量を増加させたり、培養の途中でＬ‐トリプトファンを添加して消費されたＬ‐トリプトファンを補うことにより、多能性幹細胞の増殖を促進できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りのものである。
［１］Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を１７６μＭ以上の濃度で含む、多能性幹細胞培養用の培地。
［２］培地中のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を１７６μＭ～１４０８μＭの濃度で含む、［１］の培地。
［３］無血清培地である、［１］又は［２］の培地。
［４］多能性幹細胞が誘導多能性幹細胞である、［１］～［３］のいずれかの培地。
［５］トリプトファン誘導体が、トリプトファンとアミノ酸がペプチド結合したジペプチドである、［１］～［４］のいずれかの培地。
［６］ジペプチドが、Ｌ‐アラニル‐Ｌ‐トリプトファンである、［５］の培地。
［７］［１］～［６］のいずれかの培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞の培養方法。
［８］多能性幹細胞を増殖するための方法である、［７］の方法。
［９］［１］～［６］のいずれかの培地及び多能性幹細胞を含む、多能性幹細胞培養調製物。
［１０］以下の工程を含む、多能性幹細胞の培養方法：
（１）Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を含む培地中で、多能性幹細胞を培養すること；
（２）得られた多能性幹細胞培養物に、Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を添加し、（１）で消費された培地中のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体の一部又は全部を補うこと；及び
（３）Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体が添加された多能性幹細胞培養物を、引き続き培養に付すこと。
［１１］Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を含む培地が、無血清培地である、［１０］の方法。
［１２］トリプトファン誘導体が、トリプトファンとアミノ酸がペプチド結合したジペプチドである、［１０］又は［１１］の方法。
［１３］ジペプチドが、Ｌ‐アラニル‐Ｌ‐トリプトファンである、［１２］の方法。
［１４］Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を含む、多能性幹細胞の増殖を促進するための培地添加剤。
［１５］トリプトファン誘導体が、トリプトファンとアミノ酸がペプチド結合したジペプチドである、［１４］の培地添加剤。
［１６］ジペプチドが、Ｌ‐アラニル‐Ｌ‐トリプトファンである、［１５］の培地添加剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、多能性幹細胞の細胞増殖を促進させることが可能となるため、多能性幹細胞を効率よく大量に培養することができる。本培地の使用による具体的な効果としては、従来の培地に比べて短期間に目標細胞数を得られること、大量培養に特化した培養設備への変更なしに、既存の設備のままの培養でも目標細胞数を得られることなどが期待できる。従って、多能性幹細胞の培養にかかる人的コスト及び金銭的コストを大幅に削減することができる。
【図面の簡単な説明】
（【００１１】以降は省略されています）

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