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公開番号2024052646
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-04-11
出願番号2023170652
出願日2023-09-29
発明の名称ミズワタクチビルケイソウの特異的検出
出願人国立大学法人九州大学
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/11 20060101AFI20240404BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】環境DNAからの迅速・高感度なミズワタクチビルケイソウの検出法の開発。
【解決手段】特定の塩基配列のうち、90番目のアデニンを含み、且つ連続する少なくとも14塩基からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含む核酸、当該核酸を含む、ミズワタクチビルケイソウの検出用マーカー、プライマー、又はプローブ。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
配列番号１で示される塩基配列のうち、９０番目のアデニンを含み、且つ連続する少なくとも１４塩基からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含む核酸。
続きを表示（約 1,600 文字）【請求項２】
請求項１の核酸を含む、ミズワタクチビルケイソウの検出用マーカー、プライマー、又はプローブ。
【請求項３】
以下の（１）～（４）からなる群から選択される、いずれかのプライマーセット：
（１）配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２）配列番号２に示される塩基配列の５’末端側１０塩基からなる塩基配列において、１個又は２個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットであって、遺伝子増幅法により配列番号１の配列を含むミズワタクチビルケイソウ（Ｃｙｍｂｅｌｌａｊａｎｉｓｃｈｉｉ）の２８ＳｒＲＮＡ遺伝子またはその転写産物由来のＤＮＡ断片を特異的に増幅できる、プライマーセット；
（３）配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３に示される塩基配列の５’末端側１０塩基からなる塩基配列において、１個又は２個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットであって、遺伝子増幅法により配列番号１の配列を含むミズワタクチビルケイソウの２８ＳｒＲＮＡ遺伝子またはその転写産物由来のＤＮＡ断片を特異的に増幅できる、プライマーセット；及び
（４）配列番号２に示される塩基配列の５’末端側１０塩基からなる塩基配列において、１個又は２個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号３に示される塩基配列の５’末端側１０塩基からなる塩基配列において、１個又は２個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットであって、遺伝子増幅法により配列番号１の配列を含むミズワタクチビルケイソウの２８ＳｒＲＮＡ遺伝子またはその転写産物由来のＤＮＡ断片を特異的に増幅できる、プライマーセット。
【請求項４】
請求項１の核酸を含む、ミズワタクチビルケイソウの検出用プライマー、若しくはプローブ、又は請求項３に記載のプライマーセットを含有する、ミズワタクチビルケイソウの検出用キット。
【請求項５】
配列番号１の配列を含むミズワタクチビルケイソウの２８ＳｒＲＮＡ遺伝子の全長ＤＮＡ若しくはその断片及び／又は配列番号５の配列を含むＣｙｍｂｅｌｌａｍｅｘｉｃａｎａの２８ＳｒＲＮＡ遺伝子の全長ＤＮＡ若しくはその断片を対照試料として含む、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
３’末端ミスマッチ伸長の高度選択性を有するＤＮＡポリメラーゼを更に含む、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
請求項２に記載のマーカー、プライマー、又はプローブ、或いは請求項３に記載のプライマーセットを用いて、環境試料からミズワタクチビルケイソウの２８ＳｒＲＮＡ遺伝子又はその転写産物を検出することを特徴とする、ミズワタクチビルケイソウの検出方法。
【請求項８】
配列番号６に示される塩基配列を含む核酸と、配列番号７に示される塩基配列を含む核酸と、配列番号８に示される塩基配列を含む核酸の組合わせ物。
【請求項９】
請求項８記載の組合わせ物を含有する、ミズワタクチビルケイソウの検出用キット。
【請求項１０】
配列番号１の配列を含むミズワタクチビルケイソウの２８ＳｒＲＮＡ遺伝子の全長ＤＮＡ若しくはその断片及び／又は配列番号５の配列を含むＣｙｍｂｅｌｌａｍｅｘｉｃａｎａの２８ＳｒＲＮＡ遺伝子の全長ＤＮＡ若しくはその断片を対照試料として含む、請求項９に記載のキット。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミズワタクチビルケイソウ（Ｃｙｍｂｅｌｌａｊａｎｉｓｃｈｉｉ）の特異的検出を可能にするプライマー等に関し、より詳しくは、ミズワタクチビルケイソウの２８ＳｒＲＮＡ遺伝子またはその転写産物由来のＤＮＡ断片を特異的に増幅できる、プライマー等、該プライマー等を含むキット、及び該プライマー等を用いるミズワタクチビルケイソウの検出方法等に関する。
続きを表示（約 4,700 文字）【背景技術】
【０００２】
ミズワタクチビルケイソウは近年日本に侵入した外来珪藻であり、国内の分布を急速に拡大している（非特許文献１）。大量発生すると川底の石を覆い尽くすことから、景観を損なうだけでなくアユの漁場被害が報告されるなど、河川生態系への影響が懸念されている（非特許文献２）。ミズワタクチビルケイソウの同定は、現在、形態的特徴に基づく顕微観察で行われているが、珪藻の形態分類の専門家を必要とする事、目視観察では群生形成前の初期侵入時の検出が難しいなどの問題があり、環境ＤＮＡによる迅速・高感度な検出系の開発が望まれている。珪藻は世界に約２０万種存在していると言われるが（非特許文献３）、その遺伝子情報は全世界から登録が進むｒｂｃＬのメタバーコーディング領域においてもわずか約１５００種であり、全体の１％にも満たない（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ６．ｉｎｒａｅ．ｆｒ／ｃａｒｒｔｅｌ－ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ＿ｅｎｇ／Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ－ｄａｔａｂａｓｅ／Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）。ミズワタクチビルケイソウとその近縁種の遺伝子配列はＮａｋｏｖら（非特許文献４）によって登録されているが、サンプルは主にアメリカの種に限られているために種内変異の情報が乏しく、また国内に侵入した本種および国内近縁種の配列は不明であった。また、Ｃ．ｊａｎｉｓｃｈｉｉに最も近縁なＣｙｍｂｅｌｌａｍｅｘｉｃａｎａは、Ｃ．ｊａｎｉｓｃｈｉｉとの配列間距離（ｐ－ｄｉｓｄａｎｃｅ）が登録遺伝子領域で最も変異が高い遺伝子（２８Ｓ）でも０．０３５であることから、従来法（プローブ法）による設計は困難が予想された。遺伝子による特異的検出は主に蛍光プローブ法で行われるが、種間変異の少ない領域では特異性を出せないために設計領域はかなり限られる。また、割高な蛍光プローブと蛍光を検出する高価なリアルタイムＰＣＲ装置が必要になることから、開発コストとランニングコストの面でデメリットがある。遺伝子変異の高い領域にはＩＴＳ領域があるが、本種と近縁種にはこのＩＴＳ領域の配列情報がない。ＩＴＳ領域で設計するためには、海外を含めたサンプルを収集し、新たに配列を取得する必要が生じるため、労力・時間の面で現実的ではなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
ＢｉｏＩｎｖａｓｉｏｎｓＲｅｃ．２０２２；１１：４０９－４１５．
ＢｕｌｌＹａｍａｎａｓｈｉＰｒｅｆｅｃｔＦｉｓｈＴｅｃｈｎｏｌＣｅｎｔ．２０１９；４６：３４－３８．
ＦｒｏｎｔＭａｒＳｃｉ．２０２１；８：６９８３３１．
Ｐｈｙｃｏｌｏｇｉａ．２０１４；５３：３５９－３７３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明が解決しようとする課題は、環境ＤＮＡからの迅速・高感度なミズワタクチビルケイソウの検出法の開発である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、先行研究で近縁種の配列情報が充実している既存の領域で国内本種の配列（ｒｂｃＬ、ｐｓａＢ、ｐｓｂＡ、１８Ｓ、２８Ｓの部分配列）を決定した後、２８ＳｒＲＮＡの配列に対して、限られた領域の中で本種を特異的に検出するジェノタイピングを開発した。
【０００６】
ミズワタクチビルケイソウ（Ｃ．ｊａｎｉｓｃｈｉｉの国内種）の２８ＳｒＲＮＡの部分配列とＢＬＡＳＴＳｅａｒｃｈでヒットした類似の他種（アメリカのＣ．ｊａｎｉｓｃｈｉｉを含む）の８９配列とのアラインメント結果によると、配列番号１の９０番目の塩基はアデニンであるが、上記８９配列では、配列データが表示されない場合を除き、すべてチミンであった。この発見により、本願発明によるＣ．ｊａｎｉｓｃｈｉｉの国内種の高度に特異的な検出が可能になった。
【０００７】
即ち、本発明は以下のとおりである。
［１］配列番号１で示される塩基配列のうち、９０番目のアデニンを含み、且つ連続する少なくとも１４塩基からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含む核酸。
［２］［１］の核酸を含む、ミズワタクチビルケイソウの検出用マーカー、プライマー、又はプローブ。
［３］以下の（１）～（４）からなる群から選択される、いずれかのプライマーセット：
（１）配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２）配列番号２に示される塩基配列の５’末端側１０塩基からなる塩基配列において、１個又は２個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットであって、遺伝子増幅法により配列番号１の配列を含むミズワタクチビルケイソウの２８ＳｒＲＮＡ遺伝子またはその転写産物由来のＤＮＡ断片を特異的に増幅できる、プライマーセット；
（３）配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３に示される塩基配列の５’末端側１０塩基からなる塩基配列において、１個又は２個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットであって、遺伝子増幅法により配列番号１の配列を含むミズワタクチビルケイソウの２８ＳｒＲＮＡ遺伝子またはその転写産物由来のＤＮＡ断片を特異的に増幅できる、プライマーセット；及び
（４）配列番号２に示される塩基配列の５’末端側１０塩基からなる塩基配列において、１個又は２個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号３に示される塩基配列の５’末端側１０塩基からなる塩基配列において、１個又は２個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットであって、遺伝子増幅法により配列番号１の配列を含むミズワタクチビルケイソウの２８ＳｒＲＮＡ遺伝子またはその転写産物由来のＤＮＡ断片を特異的に増幅できる、プライマーセット。
［４］［１］の核酸を含む、ミズワタクチビルケイソウの検出用プライマー、若しくはプローブ、又は［３］に記載のプライマーセットを含有する、ミズワタクチビルケイソウの検出用キット。
［５］配列番号１の配列を含むミズワタクチビルケイソウの２８ＳｒＲＮＡ遺伝子の全長ＤＮＡ若しくはその断片及び／又は配列番号５の配列を含むＣ．ｍｅｘｉｃａｎａの２８ＳｒＲＮＡ遺伝子の全長ＤＮＡ若しくはその断片を対照試料として含む、［４］に記載のキット。
［６］３’末端ミスマッチ伸長の高度選択性を有するＤＮＡポリメラーゼを更に含む、［４］又は［５］に記載のキット。
［７］［２］に記載のマーカー、プライマー、又はプローブ、或いは［３］に記載のプライマーセットを用いて、環境試料からミズワタクチビルケイソウの２８ＳｒＲＮＡ遺伝子又はその転写産物を検出することを特徴とする、ミズワタクチビルケイソウの検出方法。
［８］配列番号６に示される塩基配列を含む核酸と、配列番号７に示される塩基配列を含む核酸と、配列番号８に示される塩基配列を含む核酸の組合わせ物。
［９］［８］記載の組合わせ物を含有する、ミズワタクチビルケイソウの検出用キット。
［１０］配列番号１の配列を含むミズワタクチビルケイソウの２８ＳｒＲＮＡ遺伝子の全長ＤＮＡ若しくはその断片及び／又は配列番号５の配列を含むＣｙｍｂｅｌｌａｍｅｘｉｃａｎａの２８ＳｒＲＮＡ遺伝子の全長ＤＮＡ若しくはその断片を対照試料として含む、［９］に記載のキット。
［１１］［８］に記載の組合せ物を用いて、環境試料からミズワタクチビルケイソウの２８ＳｒＲＮＡ遺伝子又はその転写産物を検出することを特徴とする、ミズワタクチビルケイソウの検出方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、環境試料からミズワタクチビルケイソウの存在を特異的に、迅速・高感度に検出することができる。本検出法はＰＣＲ産物のバンドの有無だけでも在・不在を推定できることから、汎用のＰＣＲ装置で安価に実施できる。さらに、リアルタイムＰＣＲを伴う本発明の実施形態によれば、感度・特異性の面で難易度が高い河川水サンプルからもミズワタクチビルケイソウの存在を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
図１は、水底のミズワタクチビルケイソウの群体（左）及びミズワタクチビルケイソウの個体の顕微鏡写真（右）である。
図２は、ミズワタクチビルケイソウ及びその最も近縁なケイソウを含む３つの２８ＳｒＲＮＡ遺伝子部分配列間の比較を示す図である。下から順に、それぞれ、最も近縁なＣ．ｍｅｘｉｃａｎａ、米国内のＣ．ｊａｎｉｓｃｈｉｉ、日本国内で採取されたミズワタクチビルケイソウの２８ＳｒＲＮＡ遺伝子部分配列を示す。最上段の配列は次世代配列決定（ＮＧＳ）により同定された日本国内で採取されたミズワタクチビルケイソウの２８ＳｒＲＮＡの部分配列を示す。Ｐ２－Ｆ及びＰ２－Ｒは本発明のプライマー（それぞれ配列番号２及び３）の配列を示す。
図３は、ミズワタクチビルケイソウ検出のワークフローを示す図である。
図４は、本発明のプライマーを用いたＰＣＲによるミズワタクチビルケイソウの２８ＳｒＲＮＡ遺伝子部分配列の増幅における反応液組成（左）及びプロトコル（右）の例を示す。
図５は、実施例１の実験手順を示す図である。
図６は、実施例１の結果を示す図である。本発明のプライマーセットを用いたＰＣＲによるミズワタクチビルケイソウの２８ＳｒＲＮＡ遺伝子部分配列の増幅は定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により検出した。
図７は、本発明のプライマーセットを用いたＰＣＲによるミズワタクチビルケイソウの２８ＳｒＲＮＡ遺伝子部分配列の増幅をアガロースゲル電気泳動法により検出した結果を示す図である。
図８は、各プライマーセット（Ｐ２－ＦとＰ２－Ｒ、Ｐ１－ＦとＰ１－Ｒ）及びＰ１－プローブの位置関係を示す図である。
図９は、実施例１で設計したプライマーセット（Ｐ２）と実施例２で設計したプライマーセット（Ｐ１）の検出感度を比較した結果を示す図である。
図１０は、Ｐ１プローブを用いる場合と用いない場合の検出感度の比較を示す図である。
図１１は、Ｐ１プローブの特異性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．核酸
本発明は、配列番号１で示される塩基配列のうち、９０番目のアデニンを含み、且つ連続する少なくとも１４塩基からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を有する核酸を提供する。配列番号１は、ミズワタクチビルケイソウの２８ＳｒＲＮＡ遺伝子の断片を表す。
（【００１１】以降は省略されています）

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