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公開番号2025178999
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-12-09
出願番号2024226361
出願日2024-12-23
発明の名称低温耐性性状を持つタキフグ・オブスキュラスの全雌新種育成方法
出願人南京師範大学
代理人弁理士法人コスモス国際特許商標事務所
主分類A01K 61/10 20170101AFI20251202BHJP(農業;林業;畜産;狩猟;捕獲;漁業)
要約【課題】低温耐性性状を持つ全雌タキフグ・オブスキュラス新種育成方法を開示する。
【解決手段】本発明の育成方法では、タキフグ・オブスキュラスの性転換をホルモン誘導して性判別分子マーカーと組み合わせて偽雄タキフグ・オブスキュラスを取得し、偽雄魚と正常な雌タキフグ・オブスキュラスとを交配させて全雌タキフグ・オブスキュラスを取得し、最終的に全雌タキフグ・オブスキュラスから、低温耐性性状を持つ個体を低温耐性分子マーカーで選別し、低温耐性性状の全雌新品種を取得する。本発明では、タキフグ・オブスキュラス性別及び低温耐性のSNP分子マーカーを発見し、これら2つの重要な要素を共同利用して総合的な選別育成を行うことにより、全雌新品種を短時間に大量選別育成することができる。また、本発明で得られた低温耐性性状を持つ全雌タキフグ・オブスキュラスは、新品種の育成に優れた母体資源を提供し、広い応用見通しを有する。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
低温耐性性状を持つタキフグ・オブスキュラスの全雌新種育成方法であって、
性転換したタキフグ・オブスキュラス仔魚を性判別分子マーカーで選別し、偽雄タキフグ・オブスキュラスを取得して正常な雌タキフグ・オブスキュラスと交配させて全雌タキフグ・オブスキュラスを取得する操作ステップ（１）と、
ステップ（１）において取得された全雌タキフグ・オブスキュラスから、低温耐性性状を持つ個体をＳＮＰ部位の塩基配列がＳＥＱＩＤＮＯ．２に示される低温耐性性状分子マーカーで選別し、１５０ｂｐのストリップをＰＣＲ増幅し且つ遺伝子型がＧＧとして検出される場合、全雌低温耐性タキフグ・オブスキュラスである操作ステップ（２）とを含む、ことを特徴とする低温耐性性状を持つタキフグ・オブスキュラスの全雌新種育成方法。
続きを表示（約 1,600 文字）【請求項２】
ステップ（１）における前記性転換は、ホルモン誘導方法によって達成される、ことを特徴とする請求項１に記載の低温耐性性状を持つタキフグ・オブスキュラスの全雌新種育成方法。
【請求項３】
前記ホルモン誘導方法は、飼料に１７α－メチルテストステロンを添加することである、請求項２に記載の低温耐性性状を持つタキフグ・オブスキュラスの全雌新種育成方法。
【請求項４】
１５日齢前の孵化から体長３．３３ｃｍまでのタキフグ・オブスキュラスに給餌するために、前記１７α－メチルテストステロンを用いて使用量３０－６０ｍｇ／Ｌで輪虫を浸漬し、
１５～４０日齢のタキフグ・オブスキュラス苗に給餌するために、３０－６０ｍｇ／Ｌでアルテミアを浸漬し、
４０～１００日齢のタキフグ・オブスキュラスに給餌するために、３０－６０μg/gで飼料に添加する、ことを特徴とする請求項３に記載の低温耐性性状を持つタキフグ・オブスキュラスの全雌新種育成方法。
【請求項５】
ステップ（１）における前記性判別分子マーカーのＳＮＰ部位の塩基配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１に示され、
ＰＣＲ増幅結果が２５０ｂｐ及び３３０ｂｐの２つのストリップである場合、個体は、正常な雌魚又は偽雄魚であり、
ＰＣＲ増幅結果が１本の３３０ｂｐのストリップである場合、個体は、正常な雄魚である、ことを特徴とする請求項１に記載の低温耐性性状を持つタキフグ・オブスキュラスの全雌新種育成方法。
【請求項６】
ＰＣＲ増幅に用いられるプライマー配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３～４に示される、ことを特徴とする請求項５に記載の低温耐性性状を持つタキフグ・オブスキュラスの全雌新種育成方法。
【請求項７】
ＰＣＲ増幅に用いられるプログラムは、以下のとおりであり、
ｓｔｅｐ１：９５℃で３分予め変性し、
ｓｔｅｐ２：９５℃で３０秒変性し、
ｓｔｅｐ３：５１．５℃で３０秒アニールし、
ｓｔｅｐ４：７２℃で３０秒延ばし、
ｓｔｅｐ２～４を３５回繰り返し、
ｓｔｅｐ５：７２℃で５分延ばす、ことを特徴とする請求項５に記載の低温耐性性状を持つタキフグ・オブスキュラスの全雌新種育成方法。
【請求項８】
ステップ（１）において偽雄魚と正常な雌タキフグ・オブスキュラスとを交配させる時、手動で産卵促進し、
具体的には、雌魚にＨＣＧ１８０Ｕ／ｋｇ＋排卵誘発ＬＲＨ－Ａ２０．８μｇ／ｋｇを１回目に注射し、偽雄魚の場合、使用量を半減し、
２４時間後に２回目の注射を行い、雌魚の注射量は、ＨＣＧ３６０Ｕ／ｋｇ＋排卵誘発ＬＲＨ－Ａ２１．６μｇ／ｋｇであり、偽雄魚の場合、使用量を半減する、ことを特徴とする請求項１に記載の低温耐性性状を持つタキフグ・オブスキュラスの全雌新種育成方法。
【請求項９】
ステップ（２）におけるＰＣＲ増幅に用いられるプライマー配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．５～６に示される、ことを特徴とする請求項１に記載の低温耐性性状を持つタキフグ・オブスキュラスの全雌新種育成方法。
【請求項１０】
ステップ（２）におけるＰＣＲ増幅に用いられるプログラムは、以下のとおりであり、
ｓｔｅｐ１：９４℃で４分予め変性し、
ｓｔｅｐ２：９４℃で３０秒変性し、
ｓｔｅｐ３：５１．５℃で１分アニールし、
ｓｔｅｐ４：７２℃で４０秒延ばし、
ｓｔｅｐ２～４を３０回繰り返し、
ｓｔｅｐ５：７２℃で１０分延ばす、ことを特徴とする請求項１に記載の低温耐性性状を持つタキフグ・オブスキュラスの全雌新種育成方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、水産動物の育種分野に属し、より具体的には、低温耐性性状を持つ全雌タキフグ・オブスキュラス新種育成方法に関する。
続きを表示（約 2,200 文字）【背景技術】
【０００２】
中国の伝統的で貴重な食用魚類として、長江の三大水産物の１つであるタキフグ・オブスキュラス（Ｔａｋｉｆｕｇｕｆａｓｃｉａｔｕｓ）は、これまでおいしくてやさしくて、刺が少なく滑らかな食感によって、多くの食いしん坊を征服してきた。特に中国の長江デルタ、日本や韓国などでは、この魚を食べる歴史が長い。タキフグ・オブスキュラスの養殖と毒性抑制技術の成熟に伴い、農業農村部弁公庁と国家食品医薬品監督管理総局は、２０１６年に共同で「養殖トラフグと養殖タキフグ・オブスキュラスの加工経営を条件付きで開放することに関する通知」を発表し、タキフグ・オブスキュラスは、中国の広東、福建や江蘇省などの省での養殖面積が徐々に拡大し、中国の重要な養殖経済魚類となっている。近年、中国のタキフグ・オブスキュラスの養殖規模が拡大していることに伴い、魚苗の需要量は、ますます増大している。しかし、タキフグ・オブスキュラスの親魚養殖と魚苗の繁殖に関する企業は、親本の更新と選択育成を重視せず、親魚の老化、近親繁殖と品質の衰退現象を引き起こし、累代の繁殖を経て稚魚の成長が遅く、活着率が低く、飼料の利用効率が低下する。また、タキフグ・オブスキュラスの最適な成長温度範囲は、２３－３２℃であり、１９℃で摂食リズムが低下し、１３℃で凍傷死した。現在、タキフグ・オブスキュラスの養殖新品種であるタキフグ・オブスキュラス「中洋１号」（中国品種審査認定ＧＳ－０１－００３－２０１８）が耐えることができる最も低い温度は、７～８度に達しているが、タキフグ・オブスキュラスの養殖地域の範囲を拡大し、冬の時間を減らし、経済効果を高めるには、低温耐性をさらに強化する必要がある。従って、成長が速く、低温耐性がより強いタキフグ・オブスキュラスの新種を育成することが特に重要である。
【０００３】
トラフグ属の魚類の中で、タキフグ・オブスキュラスは、明らかな性的二形を持っており、つまり雌個体の成長速度は、雄より速く、性成熟した雌個体は、より大きく、体重、体長がいずれも雄を上回り、より高い飼料転化率を持っている。しかし、性成熟前にタキフグ・オブスキュラスの性別を外観的に区別することはできず、性成熟後にのみ、魚類の腹部を押して精液や卵子を観察することで雌雄を同定することができ、この方法は、時間がかかり、魚類の養殖コストが高い。もう１つの方法は、魚類の性腺を解剖し、性腺組織の切片観察を行い、幼魚段階で性別同定を完了することができるが、魚類に不可逆的な傷害を与え、一般的には、実験室の研究にのみ用いられる。どちらの方法も実際の生産需要を満たすことは、難しい。そのため、タキフグ・オブスキュラスを同定する性判別分子マーカーを開発し、全雌タキフグ・オブスキュラスを育成することでタキフグ・オブスキュラスの成長速度の低下を解決することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
発明目的：本発明の目的は、成長速度が速く、従来の中国品種審査認定新品種である低温耐性タキフグ・オブスキュラス「中洋１号」の耐えられる温度より２～３℃向上するタキフグ・オブスキュラスの全雌新種育成方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
技術的解決手段：本発明に記載の低温耐性性状を持つタキフグ・オブスキュラスの全雌新種育成方法であって、
性転換したタキフグ・オブスキュラス仔魚を性判別分子マーカーで選別し、偽雄タキフグ・オブスキュラスを取得して正常な雌タキフグ・オブスキュラスと交配させて全雌タキフグ・オブスキュラスを取得する操作ステップ（１）と、
ステップ（１）において取得された全雌タキフグ・オブスキュラスから、低温耐性性状を持つ個体をＳＮＰ部位の塩基配列がＳＥＱＩＤＮＯ．２に示される低温耐性性状分子マーカーで選別し、１５０ｂｐのストリップをＰＣＲ増幅し且つ遺伝子型がＧＧとして検出される場合、全雌低温耐性タキフグ・オブスキュラスである操作ステップ（２）とを含む。
【０００６】
ステップ（１）における前記性転換は、ホルモン誘導方法によって達成される。
【０００７】
前記ホルモン誘導方法は、飼料に１７α－メチルテストステロンを添加することである。
【０００８】
１５日齢前の孵化から体長３．３３ｃｍまでのタキフグ・オブスキュラスに給餌するために、前記１７α－メチルテストステロンを用いて使用量３０－６０ｍｇ／Ｌで輪虫を浸漬し、１５～４０日齢のタキフグ・オブスキュラス苗に給餌するために、３０－６０ｍｇ／Ｌでアルテミアを浸漬し、４０～１００日齢のタキフグ・オブスキュラスに給餌するために、３０－６０μg/gで飼料に添加する。
【０００９】
ステップ（１）における前記性判別分子マーカーのＳＮＰ部位の塩基配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１に示され、ＰＣＲ増幅結果が２５０ｂｐ及び３３０ｂｐの２つのストリップである場合、個体は、正常な雌魚又は偽雄魚であり、ＰＣＲ増幅結果が１本の３３０ｂｐのストリップである場合、個体は、正常な雄魚である。
【００１０】
ＰＣＲ増幅に用いられるプライマー配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３～４に示される。
（【００１１】以降は省略されています）

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