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公開番号2025171637
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-11-20
出願番号2024077163
出願日2024-05-10
発明の名称血液試料中のTHBS4陽性細胞数を測定する工程を含む、癌の診断を補助するための方法
出願人公立大学法人大阪
代理人弁理士法人三枝国際特許事務所
主分類G01N 33/48 20060101AFI20251113BHJP(測定;試験)
要約【課題】新たな癌診断用バイオマーカーの提供。
【解決手段】対象から採取された血液試料中のTHBS4陽性細胞数を測定する工程を含み、前記THBS4陽性細胞数が閾値以上である場合には、前記対象が癌に罹患している可能性が高いことが示唆され、前記THBS4陽性細胞数が前記閾値未満である場合には、前記対象が癌に罹患している可能性が低いことが示唆される、癌の診断を補助するための方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
癌の診断を補助するための方法であって、
対象から採取された血液試料中のＴＨＢＳ４陽性細胞数を測定する工程を含み、
前記ＴＨＢＳ４陽性細胞数が閾値以上である場合には、前記対象が癌に罹患している可能性が高いことが示唆され、前記ＴＨＢＳ４陽性細胞数が前記閾値未満である場合には、前記対象が癌に罹患している可能性が低いことが示唆される、癌の診断を補助するための方法。
続きを表示（約 590 文字）【請求項２】
前記閾値が、全細胞中０．５～２％である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記閾値が、ＣＤ４５陽性細胞を除く全細胞中０．３～１．５％である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記癌が胃癌、大腸癌、及び食道癌からなる群より選択される少なくとも１種の癌である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＴＨＢＳ４陽性細胞数を測定する工程が、蛍光標識された抗ＴＨＢＳ４抗体又は蛍光標識された抗ＴＨＢＳ４抗体の抗原結合性断片と、前記血液試料との接触を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＴＨＢＳ４陽性細胞数を測定する工程が、フローサイトメトリーによる前記血液試料の分析を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＴＨＢＳ４と特異的に結合可能な物質を含む試薬を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法に用いるための試薬キット。
【請求項８】
前記ＴＨＢＳ４と特異的に結合可能な物質が、抗ＴＨＢＳ４抗体又はその抗原結合性断片である、請求項７に記載の試薬キット。
【請求項９】
前記抗ＴＨＢＳ４抗体又はその抗原結合性断片が蛍光標識されている、請求項７又は８に記載の試薬キット。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本開示は、血液試料中のＴＨＢＳ４陽性細胞数を測定する工程を含む、癌の診断を補助するための方法、及び当該方法に用いるための試薬キットなどに関する。
続きを表示（約 5,600 文字）【背景技術】
【０００２】
癌の治療成績を向上させるためには、早期に癌を発見し、治療を開始することが重要である。近年、癌の早期診断技術として、血液や尿などの体液を検体として利用するリキッドバイオプシーが注目されている。画像診断や組織を検体とする癌診断と比較して、リキッドバイオプシーは一般的に対象への負担が少なく、また多数の検体を短時間で解析可能であるといった利点がある。このため、これまでに様々なリキッドバイオプシーに適したバイオマーカーが検討されており、既に臨床現場で実用化されている腫瘍マーカーもある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
Kuroda K, Yashiro M, Sera T, Yamamoto Y, Kushitani Y, Sugimoto A, et al. (2019) The clinicopathological significance of Thrombospondin-4 expression in the tumor microenvironment of gastric cancer. PLoS ONE 14(11): e0224727. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0224727
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の癌診断用バイオマーカーは精度が十分とは言えなかった。特に早期の癌はリキッドバイオプシーによる検出が困難であった。また、単一のバイオマーカーよりも複数のバイオマーカーを組み合わせた方が、癌診断の精度がより高まることが期待される。そこで本発明者らは、新たな癌診断用バイオマーカーの提供を主な目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ところで、癌組織（癌微小環境）には癌細胞だけでなく間質細胞も存在すること、間質細胞のなかでも特に癌関連線維芽細胞（CAF: cancer-associated fibroblasts）は、癌の早期段階で癌組織に出現する癌特異的な細胞であることが知られている。本発明者らは、癌早期に出現するＣＡＦを血液試料から検出できれば、癌の早期診断に役立つのではないかと考えた。
【０００６】
そこでまず、本発明者らは癌患者の組織からＣＡＦ細胞株及び正常部線維芽細胞株（ＮＦ）を樹立し、ＣＡＦ特異的に発現上昇している遺伝子を網羅的に解析した。その結果、ＴＨＢＳ４遺伝子がＣＡＦ特異的に顕著に発現上昇していることを見出した。また、タンパク質レベルでもＴＨＢＳ４がＣＡＦ特異的に発現上昇していることを確認した（試験１）。当該結果から、本発明者らはＴＨＢＳ４が新規なＣＡＦ検出マーカーとして有用である可能性を見出した。
【０００７】
次に、本発明者らはＴＨＢＳ４をマーカーとして血液試料中のＣＡＦを検出することにより、当該血液が由来する対象が癌に罹患している可能性を評価することを試みた。その結果、癌患者由来の血液試料の方が、健常者由来の血液試料と比較して有意にＴＨＢＳ４陽性細胞数が多いことを見出した。そしてさらに改良を重ね、本開示を完成させるに至った。
【０００８】
本開示は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
癌の診断を補助するための方法であって、
対象から採取された血液試料中のＴＨＢＳ４陽性細胞数を測定する工程を含み、
前記ＴＨＢＳ４陽性細胞数が閾値以上である場合には、前記対象が癌に罹患している可能性が高いことが示唆され、前記ＴＨＢＳ４陽性細胞数が前記閾値未満である場合には、前記対象が癌に罹患している可能性が低いことが示唆される、癌の診断を補助するための方法。
項２．
前記閾値が、全細胞中０．５～２％である、項１に記載の方法。
項３．
前記閾値が、ＣＤ４５陽性細胞を除く全細胞中０．３～１．５％である、項１に記載の方法。
項４．
前記癌が胃癌、大腸癌、及び食道癌からなる群より選択される少なくとも１種の癌である、項１～３のいずれか一項に記載の方法。
項５．
前記ＴＨＢＳ４陽性細胞数を測定する工程が、蛍光標識された抗ＴＨＢＳ４抗体又は蛍光標識された抗ＴＨＢＳ４抗体の抗原結合性断片と、前記血液試料との接触を含む、項１～４のいずれか一項に記載の方法。
項６．
前記ＴＨＢＳ４陽性細胞数を測定する工程が、フローサイトメトリーによる前記血液試料の分析を含む、項１～５のいずれか一項に記載の方法。
項７．
ＴＨＢＳ４と特異的に結合可能な物質を含む試薬を含む、項１～６のいずれか一項に記載の方法に用いるための試薬キット。
項８．
前記ＴＨＢＳ４と特異的に結合可能な物質が、抗ＴＨＢＳ４抗体又はその抗原結合性断片である、項７に記載の試薬キット。
項９．
前記抗ＴＨＢＳ４抗体又はその抗原結合性断片が蛍光標識されている、項７又は８に記載の試薬キット。
項１０．
前記対象が癌に罹患している場合において、
さらに、前記ＴＨＢＳ４陽性細胞数が全細胞中３．６～７．２％以上である場合には、前記対象が低分化癌に罹患している可能性が高いことが示唆され、前記ＴＨＢＳ４陽性細胞数が全細胞中３．６～７．２％未満である場合には、前記対象が分化癌に罹患している可能性が高いことが示唆される、項１～６のいずれか一項に記載の方法又は項７～９のいずれか一項に記載の試薬キット。
【発明の効果】
【０００９】
本開示によれば、新たな癌診断用バイオマーカーが提供される。当該バイオマーカーは、既に臨床現場で実用化されている腫瘍マーカーよりも高い精度で血液試料から対象の癌を検出できる可能性がある。特に、従来の癌診断用バイオマーカーでは検出が困難であった早期の癌であっても、本開示の技術によれば高い精度で検出できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
試験１：グループ１のＲＮＡ－ｓｅｑの結果を示す。
試験１：グループ１のＲＮＡ－ｓｅｑの結果を示す。
試験１：グループ１のＲＮＡ－ｓｅｑの結果を示す。
試験１：グループ１のＲＮＡ－ｓｅｑの結果を示す。
試験１：グループ２のＲＮＡ－ｓｅｑの結果を示す。
試験１：グループ２のＲＮＡ－ｓｅｑの結果を示す。
試験１：グループ２のＲＮＡ－ｓｅｑの結果を示す。
試験１：グループ２のＲＮＡ－ｓｅｑの結果を示す。
試験１：グループ２のＲＮＡ－ｓｅｑの結果を示す。
試験１：グループ２のＲＮＡ－ｓｅｑの結果を示す。
試験１：ウェスタンブロッティングの結果を示す。なお、β－アクチンは内在性コントロールである。
試験３－１：健常者群の代表的な５例について、フローサイトメトリーの結果を示す。各グラフ中の垂直方向の線は、１×１０
２
個／全細胞１０
４
個を示す。
試験３－２－１：胃癌患者群について、各ステージの代表的なフローサイトメトリーの結果を示す。各グラフ中の垂直方向の線は、１×１０
２
個／全細胞１０
４
個を示す。
試験３－２－２：健常者群（試験３－１）から採取された血液試料中のＴＨＢＳ４陽性細胞数の平均と、胃癌患者群から採取された血液試料中のＴＨＢＳ４陽性細胞数の平均との比較を示す。棒グラフの上端は各群の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。
試験３－２－２：健常者群から採取された血液試料中のＴＨＢＳ４陽性細胞数の平均と、胃癌患者群から採取された血液試料中のＴＨＢＳ４陽性細胞数の各ステージごとの平均との比較を示す。棒グラフの上端は各群の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。
試験３－２－２で作成したＲＯＣ曲線を示す。
試験３－２－２：健常者群及び各ステージの胃癌患者群について、ＴＨＢＳ４陽性細胞数がカットオフ値（１×１０
２
個）以上となる対象の割合（陽性率）を示す。
試験３－２－３：健常者群（試験３－１）から採取された血液試料中のＣＥＡ値の平均と、各ステージの胃癌患者群から採取された血液試料中のＣＥＡ値の平均との比較を示す。グラフ中の水平線は、ＣＥＡ値５．０を示す。棒グラフの上端は各群の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。
試験３－２－３：健常者群及び各ステージの胃癌患者群について、ＣＥＡ値がカットオフ値（５．０）以上となる対象の割合（陽性率）を示す。
試験３－２－３：健常者群（試験３－１）から採取された血液試料中のＣＡ１９－９値の平均と、各ステージの胃癌患者群から採取された血液試料中のＣＡ１９－９値の平均との比較を示す。グラフ中の水平線は、ＣＡ１９－９値３７．０を示す。棒グラフの上端は各群の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。
試験３－２－３：健常者群及び各ステージの胃癌患者群について、ＣＡ１９－９値がカットオフ値（３７．０）以上となる対象の割合（陽性率）を示す。
試験３－３－１：大腸癌患者群について、各ステージの代表的なフローサイトメトリーの結果を示す。各グラフ中の垂直方向の線は、ＴＨＢＳ４発現のカットオフ値としたＦＩＴＣ値１×１０
２
を示す。
試験３－３－２：健常者群（試験３－１）から採取された血液試料中のＴＨＢＳ４陽性細胞数の平均と、大腸癌患者群から採取された血液試料中のＴＨＢＳ４陽性細胞数の平均との比較を示す。棒グラフの上端は各群の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。
試験３－３－２：健常者群から採取された血液試料中のＴＨＢＳ４陽性細胞数の平均と、大腸癌患者群から採取された血液試料中のＴＨＢＳ４陽性細胞数の各ステージごとの平均との比較を示す。棒グラフの上端は各群の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。
試験３－３－２で作成したＲＯＣ曲線を示す。
試験３－３－２：健常者群及び各ステージの大腸癌患者群について、ＴＨＢＳ４陽性細胞数がカットオフ値（１×１０
２
個）以上となる対象の割合（陽性率）を示す。
試験３－４－１：食道癌患者群について、各ステージの代表的なフローサイトメトリーの結果を示す。各グラフ中の垂直方向の線は、ＴＨＢＳ４発現のカットオフ値としたＦＩＴＣ値１１×１０
２
を示す。
試験３－４－２：健常者群（試験３－１）から採取された血液試料中のＴＨＢＳ４陽性細胞数の平均と、食道癌患者群から採取された血液試料中のＴＨＢＳ４陽性細胞数の平均との比較を示す。棒グラフの上端は各群の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。
試験３－４－２：健常者群から採取された血液試料中のＴＨＢＳ４陽性細胞数の平均と、食道癌患者群から採取された血液試料中のＴＨＢＳ４陽性細胞数の各ステージごとの平均との比較を示す。棒グラフの上端は各群の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。
試験３－４－２で作成したＲＯＣ曲線を示す。
試験３－４－２：健常者群及び各ステージの食道癌患者群について、ＴＨＢＳ４陽性細胞数がカットオフ値（１×１０
２
個）以上となる対象の割合（陽性率）を示す。
試験４：健常者群の代表的な１例のフローサイトメトリーの結果を示す。矢印左側の各グラフ中の垂直方向の線は、ＴＨＢＳ４発現のカットオフ値としたＦＩＴＣ値１×１０
２
を示す。矢印の右側のグラフはＣＤ４５によるゲーティング後の結果を示し、当該グラフ中の左上の枠で囲んだ領域に存在するプロットがＴＨＢＳ４陽性ＣＤ４５陰性細胞を示す。
試験４：胃癌患者群の代表的な１例のフローサイトメトリーの結果を示す。矢印左側の各グラフ中の垂直方向の線は、ＴＨＢＳ４発現のカットオフ値としたＦＩＴＣ値１１×１０
２
を示す。矢印の右側のグラフはＣＤ４５によるゲーティング後の結果を示し、当該グラフ中の左上の枠で囲んだ領域に存在するプロットがＴＨＢＳ４陽性ＣＤ４５陰性細胞を示す。
試験４：健常者群から採取された血液試料中のＴＨＢＳ４陽性細胞数の平均と、胃癌患者群から採取された血液試料中のＴＨＢＳ４陽性細胞数の平均との比較を示す。棒グラフの上端は各群の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。
試験４：健常者群から採取された血液試料中のＴＨＢＳ４陽性細胞数の平均と、胃癌患者群から採取された血液試料中のＴＨＢＳ４陽性細胞数の各ステージごとの平均との比較を示す。棒グラフの上端は各群の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。
試験４で作成したＲＯＣ曲線を示す。
試験５：健常者群から採取された血液試料中のＴＨＢＳ４陽性細胞数の平均と、胃癌患者群から採取された血液試料中のＴＨＢＳ４陽性細胞数の分化度ごとの平均との比較を示す。棒グラフの上端は各群の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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