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公開番号2025171316
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-11-20
出願番号2024076521
出願日2024-05-09
発明の名称ポリペプチドの集合体形成能を評価する方法及び当該方法に用いるベクター
出願人公立大学法人大阪
代理人弁理士法人三枝国際特許事務所
主分類C12Q 1/02 20060101AFI20251113BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】ポリペプチドの集合体形成能を評価する方法及び当該方法に用いるベクターの提供。
【解決手段】同一の又は異なるベクターに、評価対象ポリペプチドをコードする塩基配列が付加されたvioCタンパク質及びvioEタンパク質をコードする塩基配列を含むベクターを含む細胞における、デオキシヴィオラセイン及び/又はヴィオラセイン量を測定することを含む、ポリペプチドの集合体形成能を評価する方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
同一の又は異なるベクターに、評価対象ポリペプチドをコードする塩基配列が付加されたｖｉｏＣタンパク質及びｖｉｏＥタンパク質をコードする塩基配列を含むベクターを含む細胞における、デオキシヴィオラセイン及び／又はヴィオラセイン量を測定することを含む、ポリペプチドの集合体形成能を評価する方法。
続きを表示（約 520 文字）【請求項２】
前記細胞が、前記ベクターと同一の又は異なるベクターに、ｖｉｏＡタンパク質及び／又はｖｉｏＢタンパク質をコードする塩基配列を含むベクターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、
評価対象ポリペプチドをコードする塩基配列が付加されたｖｉｏＣタンパク質及びｖｉｏＥタンパク質をコードする塩基配列を含むベクター、並びに
ｖｉｏＡタンパク質及びｖｉｏＢタンパク質をコードする塩基配列を含むベクターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
評価対象ポリペプチドをコードする塩基配列が、ｖｉｏＣタンパク質及びｖｉｏＥタンパク質をコードする塩基配列の５’末端側に付加されている、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ベクターが、プラスミドベクターである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ベクターがさらにｖｉｏＤタンパク質をコードする塩基配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１～３のいずれか１項に記載の方法に用いられるためのベクター。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本開示は、ポリペプチドの集合体形成能を評価する方法及び当該方法に用いるベクター等に関する。詳細には、同一の又は異なるベクターに、評価対象ポリペプチドをコードする塩基配列が付加されたｖｉｏＣタンパク質及びｖｉｏＥタンパク質をコードする塩基配列を含むベクターを含む細胞における、デオキシヴィオラセイン及び／又はヴィオラセイン量を測定することを含む、ポリペプチドの集合体形成能を評価する方法等に関する。
続きを表示（約 2,800 文字）【背景技術】
【０００２】
酵母において、解糖系酵素等が、低酸素条件下で、Ｇ－ｂｏｄｙ（Ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃｂｏｄｙ）と呼ばれるタンパク質集合体を形成することが知られている（非特許文献１）。これまでに、例えば、解糖系酵素エノラーゼ（Ｅｎｏ２ｐ）のＮ－末端アミノ酸配列（ｓｃＥＮＯ（１～３０））が低酸素条件下でのＧ－ｂｏｄｙの形成に寄与することが報告されている（非特許文献２）。また、酵母のピルビン酸キナーゼ（Ｃｄｃ１９ｐ）のアミノ酸配列（例えば、２１７～２４３位のアミノ酸配列；ＳＣ３）についても自己集合能を有することが報告されている（特許文献１、非特許文献３）。これらの代謝酵素の集合体形成に関与するアミノ酸配列は、「ＭｅｔａＦｏｓ－ｔａｇ（ＭＥＴＡ（ｍｅｔａｂｏｌｉｃｅｎｚｙｍｅｓｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ）ｂｏｄｙ－ｆｏｒｍｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇｓ）」と称されている。
【０００３】
代謝酵素集合体の形成には、中間体の存在量を抑えることで代謝効率を向上させることができる；反応物中間体が競合反応に使われることを防ぐことができる；不安定な中間体を保護することができる；連続した酵素反応間の待ち時間が少なくなるため、見かけの反応時間を速くすることができる等といった効果があると言われており（非特許文献４）、これまでにも例えばＦＵＳ（ＦｕｓｅｄｉｎＳａｒｃｏｍａ）と呼ばれるヒト由来のＲＮＡ結合タンパク質であり、細胞内で集合体を形成する性質を持つことが知られているポリペプチドを用いた報告等が行われている（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
特開２０２１－２３２２５号公報
【非特許文献】
【０００５】
ＣｅｌｌＲｅｐ．２０１７Ｊｕｌ２５；２０（４）：８９５－９０８．
ＥｕｋａｒｙｏｔＣｅｌｌ．２０１３Ａｕｇ；１２（８）：１１０６－１９．
ＰＬｏＳＯｎｅ．２０２３Ａｐｒ１３；１８（４）：ｅ０２８３００２．
Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．２０２２Ｊａｎ２１；１０（２）：２３２．
ＮａｔＣｈｅｍＢｉｏｌ．２０１９Ｊｕｎ；１５（６）：５８９－５９７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本開示は、ポリペプチドの集合体形成能を評価する方法及び当該方法に用いるベクターを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、Ｖｉｏｌａｃｅｉｎ（ヴィオラセイン）の生合成に関与するタンパク質ｖｉｏＣ及びｖｉｏＥに評価対象ポリペプチドを付加することで、当該ポリペプチドの集合体形成能を評価できることを見出し、さらに改良を重ねた。
【０００８】
本開示は、例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
同一の又は異なるベクターに、評価対象ポリペプチドをコードする塩基配列が付加されたｖｉｏＣタンパク質及びｖｉｏＥタンパク質をコードする塩基配列を含むベクターを含む細胞における、デオキシヴィオラセイン及び／又はヴィオラセイン量を測定することを含む、ポリペプチドの集合体形成能を評価する方法。
項２．
前記細胞が、前記ベクターと同一の又は異なるベクターに、ｖｉｏＡタンパク質及び／又はｖｉｏＢタンパク質をコードする塩基配列を含むベクターを含む、項１に記載の方法。
項３．
前記細胞が、
評価対象ポリペプチドをコードする塩基配列が付加されたｖｉｏＣタンパク質及びｖｉｏＥタンパク質をコードする塩基配列を含むベクター、並びに
ｖｉｏＡタンパク質及びｖｉｏＢタンパク質をコードする塩基配列を含むベクターを含む、項１に記載の方法。
項４．
評価対象ポリペプチドをコードする塩基配列が、ｖｉｏＣタンパク質及びｖｉｏＥタンパク質をコードする塩基配列の５’末端側に付加されている、項１～３のいずれか１項に記載の方法。
項５．
前記ベクターが、プラスミドベクターである、項１～３のいずれか１項に記載の方法。
項６．
前記ベクターがさらにｖｉｏＤタンパク質をコードする塩基配列を含む、項１～３のいずれか１項に記載の方法。
項７．
項１～３のいずれか１項に記載の方法に用いられるためのベクター。
項８．
同一の又は異なるベクターに、配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；又は配列番号１３に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、集合体形成能を有するポリペプチドをコードする塩基配列が付加された２個以上の任意の酵素をコードする塩基配列を含むベクターを含む細胞を培養することを含む、有用物質の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
ポリペプチドの集合体形成能を評価する方法が提供される。また、当該方法に用いるベクターが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
Ｖｉｏｌａｃｅｉｎ生合成経路の概略図を示す。
実験例１で用いたプラスミドの構造を示す。
顕微鏡観察の結果を示す（スケールバー＝１０μｍ）。
ＨＰＬＣ分析によるＶｉｏｌａｃｅｉｎ生成量及びＤｅｏｘｙｖｉｏｌａｃｅｉｎ生成量の測定結果を示す（ｎ＝３、ｂａｒ＝ｍｅａｎ±ＳＤ、ｔ－ｔｅｓｔ、＊Ｐ＜０．０５、Ｎ．Ｓ．：有意差なし）。
Ｖｉｏｌａｃｅｉｎ生成量を１としたときの、Ｄｅｏｘｙｖｉｏｌａｃｅｉｎ生成量の産出結果を示す（ｎ＝３、ｂａｒ＝ｍｅａｎ±ＳＤ、ｔ－ｔｅｓｔ、＊Ｐ＜０．０５）。
実験例２で用いたプラスミドの構造を示す。
顕微鏡観察の結果を示す（スケールバー＝１０μｍ）。
ＨＰＬＣ分析によるＤｅｏｘｙｖｉｏｌａｃｅｉｎ生成量の測定結果を示す（ｎ＝３、ｂａｒ＝ｍｅａｎ±ＳＤ、Ｔｕｋｅｙ－ｔｅｓｔ、Ｎ．Ｓ．：有意差なし、Ｐ＜０．０５を異なるアルファベットで示した）。
Ｖｉｏｌａｃｅｉｎ生成量を１としたときの、Ｄｅｏｘｙｖｉｏｌａｃｅｉｎ生成量の産出結果を示す（ｎ＝３、ｂａｒ＝ｍｅａｎ±ＳＤ、Ｔｕｋｅｙ－ｔｅｓｔ、Ｐ＜０．０５を異なるアルファベットで示した）。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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