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公開番号2025079552
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-05-22
出願番号2023192296
出願日2023-11-10
発明の名称核酸配列編集方法及び核酸配列製造方法
出願人公立大学法人大阪
代理人個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/09 20060101AFI20250515BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】ノックインされる核酸断片が長いホモロジーアームを必要としない核酸配列編集方法及び核酸配列製造方法の提供。
【解決手段】ガイド配列及びタンパク質結合配列を含むガイドRNAと、CRISPR酵素と、二本鎖である標的核酸とを会合させることと、前記CRISPR酵素により前記標的核酸を切断し、第1の突出末端を有する切断部分を形成することと、前記第1の突出末端の塩基配列と相補的な配列を含む第2の突出末端を両末端に有する核酸断片を前記標的核酸の切断部分に挿入すること、を含み、前記ガイド配列が、前記標的核酸と相補的な配列を含み、前記タンパク質結合配列は、前記CRISPR酵素と会合する領域であり、前記核酸断片が、前記第2の突出末端に挟まれる二本鎖を有する、核酸配列編集方法。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
ガイド配列及びタンパク質結合配列を含むガイドＲＮＡと、ＣＲＩＳＰＲ酵素と、二本鎖である標的核酸とを会合させることと、
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素により前記標的核酸を切断し、第１の突出末端を有する切断部分を形成することと、
前記第１の突出末端の塩基配列と相補的な配列を含む第２の突出末端を両末端に有する核酸断片を前記標的核酸の切断部分に挿入すること、を含み、
前記ガイド配列が、前記標的核酸と相補的な配列を含み、
前記タンパク質結合配列は、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素と会合する領域であり、
前記核酸断片が、前記第２の突出末端に挟まれる二本鎖を有する、核酸配列編集方法。
続きを表示（約 900 文字）【請求項２】
前記第２の突出末端が、前記第１の突出末端と相補的な前記配列の５’末端側に隣接する塩基配列をさらに含み、
前記第１の突出末端と相補的な前記配列の５’末端側に隣接する塩基配列が、前記第１の突出末端の３’末端側に隣接する前記標的核酸と相補的な塩基配列を含む、請求項１に記載の核酸配列編集方法。
【請求項３】
前記第２の突出末端における、前記第１の突出末端と相補的な前記配列の５’末端側に隣接する前記塩基配列が、５～２０塩基である、請求項２に記載の核酸配列編集方法。
【請求項４】
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、Ｃａｓ１２ｊ８、Ｃａｓ１２ａ又はＣａｓ９ニッカーゼである、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸配列編集方法。
【請求項５】
前記標的核酸が０．５～２０ｋｂｐ以上のベクター又はゲノムＤＮＡである、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸配列編集方法。
【請求項６】
前記核酸断片が１０ｂｐ～２０ｋｂｐである、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸配列編集方法。
【請求項７】
さらに、前記ガイドＲＮＡをコードする配列を含むベクターと、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列を含むベクターと、前記核酸断片と、を細胞にトランスフェクトすることを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸配列編集方法。
【請求項８】
さらに、前記ガイドＲＮＡをコードする配列と前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列を含むベクターと、前記核酸断片と、を細胞にトランスフェクトすることを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸配列編集方法。
【請求項９】
前記細胞が、ヒト胎児腎細胞、ＣＨＯ細胞及びＣｏｓ７細胞からなる群から選択される一種である、請求項７に記載の核酸配列編集方法。
【請求項１０】
前記細胞が、ヒト胎児腎細胞、ＣＨＯ細胞及びＣｏｓ７細胞からなる群から選択される一種である、請求項８に記載の核酸配列編集方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸配列編集方法及び核酸配列製造方法に関する。
続きを表示（約 3,600 文字）【背景技術】
【０００２】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated proteins）システムは、次世代のゲノム編集技術として注目を集めている。中でもＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼとして、Ｃａｓ９を用いる方法は、盛んに研究が進められている。
【０００３】
特許文献１は、Ｃａｓ９を用いたゲノム編集について開示している。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムでは、Ｃａｓ９と、標的ＤＮＡ配列と相同な配列を有するガイドＲＮＡとを共発現させ、標的ＤＮＡを切断する。このように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、標的ＤＮＡ配列と相同な配列を有するガイドＲＮＡを合成し、単一のタンパク質であるＣａｓ９を用いてゲノム編集が可能であるという利点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
国際公開第２０１４／０９３６６１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Ｃａｓ９によって標的二本鎖ＤＮＡを切断すると、その切断箇所は平滑末端となる。そのため、切断箇所に遺伝子ノックインを行う場合、ノックインされる核酸断片（以降、ノックインドナーともいう）は、標的二本鎖ＤＮＡの切断箇所と隣接する配列に相同性のある長いホモロジーアームを必要とする。例えば、ノックインドナーが１～数十ｂｐ程度のオリゴＤＮＡ断片である場合、一般的に４０塩基以上のホモロジーアームが用いられる。ノックインドナーが数百ｂｐ程度以上の遺伝子のノックインでは、一般的に５００ｂｐ～２ｋｂｐ程度のホモロジーアームが用いられる。
【０００６】
本発明の目的は、ノックインされる核酸断片が長いホモロジーアームを必要としない核酸配列編集方法及び核酸配列製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の態様を包含する。
［１］ガイド配列及びタンパク質結合配列を含むガイドＲＮＡと、ＣＲＩＳＰＲ酵素と、二本鎖である標的核酸とを会合させることと、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素により前記標的核酸を切断し、第１の突出末端を有する切断部分を形成することと、前記第１の突出末端の塩基配列と相補的な配列を含む第２の突出末端を両末端に有する二本鎖の核酸断片を前記標的核酸の切断部分に挿入すること、を含み、前記ガイド配列が、前記標的核酸と相補的な配列を含み、前記タンパク質結合配列は、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素と会合する領域であり、前記核酸断片が、前記第２の突出末端に挟まれる二本鎖を有する、核酸配列編集方法。
［２］前記第２の突出末端が、前記第１の突出末端と相補的な前記配列の５’末端側に隣接する塩基配列をさらに含み、前記第１の突出末端と相補的な前記配列の５’末端側に隣接する塩基配列が、前記第１の突出末端の３’末端側に隣接する前記標的核酸と相補的な塩基配列を含む、［１］に記載の核酸配列編集方法。
［３］前記第２の突出末端における、前記第１の突出末端と相補的な前記配列の５’末端側に隣接する前記塩基配列が、５～２０塩基である、［２］に記載の核酸配列編集方法。
［４］前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、Ｃａｓ１２ｊ８、Ｃａｓ１２ａ又はＣａｓ９ニッカーゼである、［１］～［３］のいずれか一項に記載の核酸配列編集方法。
［５］前記標的核酸が０．５～２０ｋｂｐ以上のベクター又はゲノムＤＮＡである、［１］～［４］のいずれか一項に記載の核酸配列編集方法。
［６］前記核酸断片が１０ｂｐ～２０ｋｂｐである、［１］～［５］のいずれか一項に記載の核酸配列編集方法。
［７］さらに、前記ガイドＲＮＡをコードする配列を含むベクターと、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列を含むベクターと、前記核酸断片と、を細胞にトランスフェクトすることを含む、［１］～［６］のいずれか一項に記載の核酸配列編集方法。
［８］さらに、前記ガイドＲＮＡをコードする配列と前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列を含むベクターと、前記核酸断片と、を細胞にトランスフェクトすることを含む、［１］～［６］のいずれか一項に記載の核酸配列編集方法。
［９］前記細胞が、ヒト胎児腎細胞、ＣＨＯ細胞及びＣｏｓ７細胞からなる群から選択される一種である、［７］に記載の核酸配列編集方法。
［１０］前記細胞が、ヒト胎児腎細胞、ＣＨＯ細胞及びＣｏｓ７細胞からなる群から選択される一種である、［８］に記載の核酸配列編集方法。
［１１］ガイド配列及びタンパク質結合配列を含むガイドＲＮＡと、ＣＲＩＳＰＲ酵素と、二本鎖である標的核酸と会合させることと、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素により前記標的核酸を切断し、第１の突出末端を有する切断部分を形成することと、前記第１の突出末端の塩基配列と相補的な配列を含む第２の突出末端を有する二本鎖の核酸断片を前記標的核酸の切断面に挿入して核酸配列を得ること、を含み、前記ガイド配列が、前記標的核酸と相補的な配列を含み、前記タンパク質結合配列は、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素と会合する領域であり、前記核酸断片が、前記第２の突出末端に挟まれる二本鎖を有する、核酸配列製造方法。
［１２］前記第２の突出末端が、前記第１の突出末端と相補的な前記配列の５’末端側に隣接する塩基配列をさらに含み、前記第１の突出末端と相補的な前記配列の５’末端側に隣接する塩基配列が、前記第１の突出末端の３’末端側に隣接する前記標的核酸と相補的な塩基配列を含む、［１１］に記載の核酸配列製造方法。
［１３］前記第２の突出末端における、前記第１の突出末端と相補的な前記配列の５’末端側に隣接する前記塩基配列が、５～２０塩基である、［１１］又は［１２］に記載の核酸配列製造方法。
［１４］前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、Ｃａｓ１２ｊ８、Ｃａｓ１２ａ又はＣａｓ９ニッカーゼである、［１１］～［１３］のいずれか一項に記載の核酸配列製造方法。
［１５］前記標的核酸が０．５～２０ｋｂｐ以上のベクター又はゲノムＤＮＡである、［１１］～［１４］のいずれか一項に記載の核酸配列製造方法。
［１６］前記核酸断片が１０ｂｐ～２０ｋｂｐである、［１１］～［１５］のいずれか一項に記載の核酸配列製造方法。
［１７］さらに、前記ガイドＲＮＡをコードする配列を含むベクターと、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列を含むベクターと、前記核酸断片と、を細胞にトランスフェクトすることを含む、［１１］～［１６］のいずれか一項に記載の核酸配列製造方法。
［１８］さらに、前記ガイドＲＮＡをコードする配列と前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列を含むベクターと、前記核酸断片と、を細胞にトランスフェクトすることを含む、［１１］～［１６］のいずれか一項に記載の核酸配列製造方法。
［１９］前記細胞が、ヒト胎児腎細胞、ＣＨＯ細胞及びＣｏｓ７細胞からなる群から選択される一種である、［１７］に記載の核酸配列製造方法。
［２０］前記細胞が、ヒト胎児腎細胞、ＣＨＯ細胞及びＣｏｓ７細胞からなる群から選択される一種である、［１８］に記載の核酸配列製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
上記態様によれば、ノックインされる核酸断片が長いホモロジーアームを必要としない核酸配列編集方法及び核酸配列製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
一実施形態に係る核酸配列編集方法及び核酸配列製造方法を説明する概略図である。
一実施形態に係る核酸配列編集方法及び核酸配列製造方法を説明する概略図である。
他の実施形態に係る核酸断片の一部を示す概略図である。
実験例１に係る標的ベクターを示す概略図である。
実施例１－１～１－２及び比較例１－１～１－３で測定された蛍光強度を示すグラフである。
実験例２に係る標的核酸の配列の一部を示す概略図である。
実施例２で観察された細胞の蛍光顕微鏡画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
〈定義〉
「核酸」は、一本鎖又は二本鎖いずれかの形態でのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）又は、そのポリマーを指す。「核酸配列」は、一本鎖又は二本鎖いずれかの形態でのＤＮＡ又はＲＮＡのポリマーを指す。
（【００１１】以降は省略されています）

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