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公開番号2025160659
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-10-23
出願番号2024063344
出願日2024-04-10
発明の名称トランスフェリンレセプターを認識する物質の薬効予測マーカー
出願人学校法人東海大学,株式会社ペルセウスプロテオミクス
代理人弁理士法人特許事務所サイクス
主分類C12Q 1/6851 20180101AFI20251016BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】TfRを認識する物質による薬効の予測マーカーとなる因子を見出すこと、又は該マーカーを用いて薬効を予測するための方法を提供する。あるいは、該マーカーによって薬効が予測された対象に投与するための、TfRを認識する物質を含む剤を提供する。
【解決手段】トランスフェリンレセプター(TfR)を認識する物質の薬効を予測するための指標としての、L型アミノ酸トランスポーター1(LAT1)の使用、又はmTORの使用;対象由来の試料におけるLAT1の発現若しくはLAT1をコードする遺伝子の発現を分析すること、又はmTORの活性を分析すること含む、TfRを認識する物質の薬効を予測するための方法;並びに、TfRを認識する物質を含む、LAT1又はmTORを指標として前記剤の薬効が有効と予測された対象に投与するための剤が提供される。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
トランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）を認識する物質の薬効を予測するための指標としての、Ｌ型アミノ酸トランスポーター１（ＬＡＴ１）の使用。
続きを表示（約 810 文字）【請求項２】
薬効を予測する対象由来の試料におけるＬＡＴ１又はＬＡＴ１をコードする遺伝子の発現を分析することを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ＴｆＲを認識する物質の薬効を予測するための指標としての、ｍＴＯＲの使用。
【請求項４】
薬効を予測する対象由来の試料におけるｍＴＯＲの活性を分析することを含む、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
ｍＴＯＲの活性の分析が、ｍＴＯＲＣ遺伝子及びＭｙｃ遺伝子の少なくとも１以上の発現の分析を含む、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
ＴｆＲを認識する物質が、トランスフェリンとＴｆＲとの結合を阻害する抗体である、請求項１～５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
ＴｆＲを認識する物質が、ヒトＴｆＲを認識する抗体である、請求項１～５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
ヒトＴｆＲを認識する抗体が、ヒトＴｆＲの６２９番目～６３３番目の１以上のアミノ酸を認識する抗体、又はヒトＴｆＲの６２９番目～６３３番目の１以上のアミノ酸への他の抗体の結合を阻害する抗体である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記抗体が、重鎖第１相補性決定領域（ＶＨＣＤＲ１）、重鎖第２相補性決定領域（ＶＨＣＤＲ２）、重鎖第３相補性決定領域（ＶＨＣＤＲ３）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、かつ軽鎖第１相補性決定領域（ＶＬＣＤＲ１）、軽鎖第２相補性決定領域（ＶＬＣＤＲ２）、軽鎖第３相補性決定領域（ＶＬＣＤＲ３）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体である、請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
前記抗体が、重鎖が配列番号７を有し、軽鎖が配列番号８を有する抗体である、請求項７に記載の使用。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスフェリンレセプターを認識する物質の薬効予測マーカー及びその利用に関する。
続きを表示（約 7,700 文字）【背景技術】
【０００２】
ヒトトランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）と特異的に反応する抗体が見出されており（特許文献１）、この抗体による抗腫瘍効果（非特許文献１、特許文献１－２）や、細胞内への鉄の取り込みの阻害効果（特許文献３）が明らかになっている。
【０００３】
一方、ＴｆＲと特異的に反応する抗体による効果に対して、特定の細胞は抵抗性を示すことが知られている（非特許文献２）。このことから、この効果は微小環境因子により決定されるという仮説が導かれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
国際公開ＷＯ２０１４／０７３６４１号
国際公開ＷＯ２０２３／２０４１８１号
国際公開ＷＯ２０２０／１０５６２１号
【非特許文献】
【０００５】
Ogama Y, Kumagai Y, Komatsu N, et al. Phase 1 Clinical Trial of PPMX-T003, a Novel Human Monoclonal Antibody Specific for Transferrin Receptor 1, to Evaluate Its Safety, Pharmacokinetics, and Pharmacodynamics. Clin Pharmacol Drug Dev. 2023;12(6):579-587. doi:10.1002/cpdd.1216
Kameda K, Yanagiya R, Miyatake Y, et al. The hepatic niche leads to aggressive natural killer cell leukemia proliferation through the transferrin-transferrin receptor 1 axis. Blood. 2023;142(4):352-364. doi:10.1182/blood.2022018597
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＴｆＲを認識する物質による薬効の予測マーカーとなる因子を見出すこと、該マーカーを用いて薬効を予測するための方法を提供すること、又は薬効の予測による患者層別化を目的とする。あるいは、本発明は、該マーカーによって薬効が予測された対象に投与するための、ＴｆＲを認識する物質を含む剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以下の発明が提供される。
［１］トランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）を認識する物質の薬効を予測するための指標としての、Ｌ型アミノ酸トランスポーター１（ＬＡＴ１）の使用。
［２］薬効が有効を予測する対象由来の試料におけるＬＡＴ１又はＬＡＴ１をコードする遺伝子の発現を分析することを含む、［１］に記載の使用。
［３］ＴｆＲを認識する物質の薬効を予測するための指標としての、ｍＴＯＲの使用。
［４］薬効を予測する対象由来の試料におけるｍＴＯＲの活性を分析することを含む、［３］に記載の使用。
［５］ｍＴＯＲの活性の分析が、ｍＴＯＲＣ遺伝子及びＭｙｃ遺伝子の少なくとも１以上の発現の分析を含む、［４］に記載の使用。
［６］ＴｆＲを認識する物質が、トランスフェリンとＴｆＲとの結合を阻害する抗体である、［１］～［５］のいずれか１つに記載の使用。
［７］ＴｆＲを認識する物質が、ヒトＴｆＲを認識する抗体である、［１］～［６］のいずれか１つに記載の使用。
［８］ヒトＴｆＲを認識する抗体が、ヒトＴｆＲの６２９番目～６３３番目の１以上のアミノ酸を認識する抗体、又はヒトＴｆＲの６２９番目～６３３番目の１以上のアミノ酸への他の抗体の結合を阻害する抗体である、［７］に記載の使用。
［９］前記抗体が、重鎖第１相補性決定領域（ＶＨＣＤＲ１）、重鎖第２相補性決定領域（ＶＨＣＤＲ２）、重鎖第３相補性決定領域（ＶＨＣＤＲ３）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、かつ軽鎖第１相補性決定領域（ＶＬＣＤＲ１）、軽鎖第２相補性決定領域（ＶＬＣＤＲ２）、軽鎖第３相補性決定領域（ＶＬＣＤＲ３）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体である、［６］～［８］のいずれか１つに記載の使用。
［１０］前記抗体が、重鎖が配列番号７を有し、軽鎖が配列番号８を有する抗体である、［１］～［９］のいずれか１つに記載の使用。
［１１］前記薬効が、抗がん効果である、［１］～［１０］のいずれか１つに記載の使用。
［１２］対象由来の試料におけるＬＡＴ１の発現又はＬＡＴ１をコードする遺伝子の発現を分析することを含む、
ＴｆＲを認識する物質の薬効を予測するための方法。
［１３］対象由来の試料におけるｍＴＯＲの活性を分析することを含む、
ＴｆＲを認識する物質の薬効を予測するための方法。
［１４］ｍＴＯＲの活性の分析が、ｍＴＯＲＣ遺伝子及びＭｙｃ遺伝子の少なくとも１以上の発現の分析を含む、［１３］に記載の方法。
［１５］ＴｆＲを認識する物質が、トランスフェリンとＴｆＲとの結合を阻害する抗体である、［１２］～［１４］のいずれか１つに記載の使用。
［１６］ＴｆＲを認識する物質が、ヒトＴｆＲを認識する抗体である、［１２］～［１５］のいずれか１つに記載の方法。
［１７］ヒトＴｆＲを認識する抗体が、ヒトＴｆＲの６２９番目～６３３番目の１以上のアミノ酸を認識する抗体、又はヒトＴｆＲの６２９番目～６３３番目の１以上のアミノ酸への他の抗体の結合を阻害する抗体である、［１６］に記載の方法。
［１８］前記抗体が、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号１、２、３であり、かつＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体である、［１５］～［１７］のいずれか１つに記載の方法。
［１９］前記抗体が、重鎖が配列番号７を有し、軽鎖が配列番号８を有する抗体である、［１５］～［１８］のいずれか１つに記載の方法。
［２０］前記薬効が、抗がん効果である、［１２］～［１９］のいずれか１つに記載の方法。
［２１］ＴｆＲを認識する物質を含む剤であって、ＬＡＴ１又はｍＴＯＲを指標として前記剤の薬効が有効と予測された対象に投与するための、剤。
［２２］ＴｆＲを認識する物質を、ＬＡＴ１又はｍＴＯＲを指標として前記剤の薬効が有効と予測された対象に投与すること含む、がんの治療方法。ＬＡＴ１又はｍＴＯＲを指標として前記剤の薬効が有効と予測された対象に投与するための、ＴｆＲを認識する物質、又はＴｆＲを認識する物質を含む剤。ＬＡＴ１又はｍＴＯＲを指標として前記剤の薬効が有効と予測された対象に投与するための剤の製造における、ＴｆＲを認識する物質の使用、又はＴｆＲを認識する物質を含む剤の使用。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＴｆＲを認識する物質の薬効を予測するために有用な手法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
脾臓及び骨髄のANKL細胞は、抗TfR1抗体PPMX-T003による治療に抵抗性であった。図１ａは、非特許文献２に記載される2種類のANKL-PDX（ANKL1-PDX及びANKL3-PDX）のPPMX-T003による処理前（IVLA1）、処理初期（IVLA2）、処理後期（IVLA3）のin vivoルシフェラーゼアッセイ（IVLA）の結果を示す。図１ｂは、密度勾配遠心法を用いて肝細胞を除去した後のヒトCD45
+
細胞を、図１ａに記載されるPPMX-T003による処理前及び処理後早期のANKL1-PDXの肝臓及び脾臓の細胞懸濁液のフローサイトメトリー分析を用いて示す。図１ｃは、ヘマトキシリン・エオシン（HE）染色及び抗ヒトCD56抗体による免疫組織化学を示す。低倍率野の写真の四角は高倍率野の位置を示す。
図２ａは、鉄要求性分子を標的としたin vivo CRISPRスクリーニングの模式図を示す。この手順は独立して3回行われ、3匹のマウス（マウス#1、マウス#2、マウス#3）が解析された。図２ｂ～ｄは、（ｂ）マウス#1、（ｃ）マウス#2、（ｄ）マウス#3のそれぞれの全遺伝子のポジティブセレクション-Robust Ranking Algorithm（RRA）スコアを示す。図中の点は非標的sgRNAのRRA値を示す。
図３ａは、評価した3匹のマウスにおいて、GSEAによりドロップアウトした（ネガティブに選択された）sgRNAが標的とした遺伝子セットのアノテーションを示す。5つの遺伝子セットが、カットオフ値より低いネガティブセレクション-RRAスコアで共通して検出された。図３ｂ～ｄは、GSEAを用いて（ｂ）マウス#1、（ｃ）マウス#2、（ｄ）マウス#3のそれぞれにおいて負に選択されたsgRNAが標的とする全てのアノテーションされた遺伝子セットを示す。色の値は偽発見率（FDR）を、赤色の文字は図３ａで説明した5つの一般的なアノテーション遺伝子セットをそれぞれ示す。
図４ａは、マウス#1の全遺伝子のネガティブセレクションRRAスコアを示す。赤、緑、黄色の点はそれぞれMSigDB HALLMARKで酸化的リン酸化、DNA修復、E2Fターゲットにアノテーションされた遺伝子を示す。図４ｂは、全3マウスにおけるHALLMARK遺伝子セットのDNA修復及びE2Fターゲットに分類される遺伝子を標的とする一般的にドロップアウトしたsgRNAとそのネガティブセレクションRRAスコアの順位を示す。図４ｃは、図５ｃに示すγH2AX
+
細胞割合の測定結果を示す。各処置群につき合計3サンプルを解析した。
図５ａは、コネクティビティスコアリング分析のための試料調製の模式図を示す。図５ｂは、JFCR LinCAGEを用いたコネクティビティスコアリング解析の順位を示す。DNA損傷を引き起こす細胞傷害性薬剤を赤文字で記載した。図５ｃは、PPMX-T003に曝露したNK92及びKHYG1のフローサイトメトリー解析の結果を示す。分析前に10 μg/mL PPMX-T003添加又は無添加で細胞を24時間培養した。細胞周期（DNA含量）とDNA損傷の関係をプロットした。
図６ａは、シングルセル全トランスクリプトーム解析のためのサンプル調製の模式図を示す。図６ｂは、各シングルセルトランスクリプトーム解析クラスターにおける上位10の特徴遺伝子のヒートマップである。図６ｃは、解析したANKL1細胞の教師なしクラスタリング（UMAP）を示す。棒グラフは各クラスターの細胞集団を示す。図６ｄは、クラスター1の特徴遺伝子のGSEAを示す。MSigDBのHALLMARKで、調整後p値が0.25以下の全てのアノテーション遺伝子セットを記載した。
図７ａ～ｂは、クラスターごとに解析した全脾臓由来細胞のMYC（ａ）とTFRC（ｂ）の発現プロファイルを示す。各色は各細胞タイプにおける発現量を表す。図７ｃは、解析した全脾臓由来細胞の細胞周期スコアリング解析結果（左）と、細胞周期の遷移を表す模式図（右）を示す。図７ｄ～ｅは、様々な濃度のラパマイシンと10 μg/mLのPPMX-T003とで48時間in vitro処理したNK92のアポトーシスアッセイ（ｄ）とMTT細胞生存率アッセイ（ｅ）の結果を示す。
図８ａ～ｂは、KEGGパスウェイデータベースを用いて、肝臓由来の（ａ）ANKL1細胞又は（ｂ）ANKL3細胞を正常NK細胞と比較したGSEAの結果を示す。調整後のpp値が0.25未満の代謝に関連するパスウェイが抽出された。図８ｃは、肝臓由来のANKL細胞と正常NK細胞を比較した「FATTY_ACID_METABOLISM」（脂肪酸代謝）と「GLYCOLYSIS」（解糖）のGSEAプロットを示す。図８ｄは、肝臓由来のANKL細胞におけるシステイン及びメチオニン代謝のGSEAプロットと、健康なボランティア由来の正常NK細胞との比較を示す。
図９ａは、図８ａの「KEGG_CYSTEIN_AND METHIONINE_METABOLISM」のパスビューを示す（肝臓常在ANKL1細胞 vs 正常NK細胞）。黄色のひし形、オレンジの破線、及び紫の破線は、メチオニン、メチオニンサイクル、ポリアミン合成経路をそれぞれ示す。図９ｂは、肝臓由来ANKL細胞と正常NK細胞のトランスクリプトームのボルケーノプロットを示す。赤（増加）と青（減少）のドットはSLCファミリー遺伝子を示し、注釈付きドットはアミノ酸トランスポーターを示す。図９ｃ～ｆは、単一アミノ酸欠乏RPMI1640で培養した肝臓由来ANKL細胞及びANKL由来細胞株のin vitro細胞増殖アッセイの結果を示す。各バーは、すべてのアミノ酸を含む条件に対する相対増殖値を示す。赤線は、これらのアッセイのカットオフ値である0.5の相対増殖値を示す。各処理群につき合計3サンプルを分析した。
図１０ａは、図６のシングルセル全トランススクリプトーム解析のクラスター1の特徴遺伝子を他のクラスターと比較したボルケーノプロットを示す。赤い点はSLCファミリー遺伝子、アンダーバーはアミノ酸トランスポーターをコードする遺伝子をそれぞれ示す。図１０ｂ～ｃは、図６に記載したシングルセル全トランスクリプトーム解析のSLC7A5（ｂ）とSLC1A5（ｃ）のバイオリンプロットを示す。図１０ｄは、レンチウイルスベクターによりsgRNA-RFPプラスミドを導入したCas9過剰発現NK92細胞のin vitro競合増殖アッセイの結果を示す。レンチウイルス導入の2日後及び8日後にフローサイトメトリーを用いてRFP蛍光陽性細胞（すなわち、標的遺伝子ノックアウト細胞）の割合を測定した。％RFP positive cellsは、8日目のRFP蛍光陽性細胞数を2日目の細胞数で割って求めた。各処理群につき合計3サンプルを分析した。図１０ｅは、sgSLC7A5によるLAT1のノックアウト効率を検証するために、非標的sgRNA（sgNT）、sgSLC7A5、及び空（偽）のRFPプラスミドで形質導入したCas9過剰発現NK92細胞のウエスタンブロットの結果を示す。
図１１ａは、Cas9とsgRNAを導入したANKL3細胞のin vivo競合増殖アッセイのスキームを示す。図１１ｂは、sgNT-RFPプラスミド又はsgSLC7A5-RFPプラスミドで形質導入したCas9過剰発現ANKL3細胞を用いて樹立したANKL3-PDXのin vivoルシフェラーゼアッセイの結果を示す。アッセイはANKL3細胞接種の7日後に行った。肝臓領域の発光強度を測定した。実験は独立に3回行い、統計値はpaired t-testを用いて算出した。図１１ｃは、図１１ｂのin vivoルシフェラーゼアッセイのタイミングにおける肝臓由来ANKL3細胞のRFP蛍光陽性細胞（すなわち標的遺伝子ノックアウト細胞）の割合をフローサイトメトリーを用いて測定した結果を示す。
図１２ａ～ｂは、ANKL由来細胞株（ａ）、肝臓由来ANKL-PDX細胞（ｂ）、及び健康なボランティアの末梢血由来正常リンパ球（ｂ）を、様々な濃度のJPH-203で48時間（ａ）又は24時間（ｂ）処理した場合の増殖アッセイを示す。各処理群につき合計3サンプルを分析した。図１２ｃは、JPH-203で処理したNK92及びKHYG1細胞の細胞周期アッセイの結果を示す。40 μM JPH-203で24時間培養後、フローサイトメトリーを用いて細胞周期の割合を測定した。各処理群につき合計3サンプルを分析した。図１２ｄは、JPH-203で処理したNK92及びKHYG1細胞のウエスタンブロット解析の結果を示す。40 μMのJPH-203で0、6、24時間培養した後、β-アクチンと比較した各バンドの相対蛍光強度を計算し、バンドの下に記載した。
図１３は、図１２ｄに示したウエスタンブロッティングの非切抜き写真を示す。
図１４ａ～ｂは、40 μMのJPH-203で6時間処理した（ａ）NK92及び（ｂ）KHYG1のTFRC転写の定量的PCRの結果を示す。図１４ｃは、図１４ｄに示すFerroOrange由来蛍光の測定結果を示す。図１４ｄは、FerroOrangeを用いた、コントロール又は40 μM JPH-203で処理したNK92及びKHYG1細胞の細胞内第一鉄イオン（Fe
2+
）染色の結果を示す。
図１５ａは、フローサイトメトリーを用いて、40 μMのJPH-203及び/又は10 μg/mLのPPMX-T003を添加又は無添加で24時間培養したNK92細胞及びKHYG1細胞の細胞内γH2AX発現値を測定した結果を示す。各処理群につき合計3サンプルを分析した。図１５ｂは、PPMX-T003、DMSO又はJPH-203で順次処理したANKL3-PDXのin vivoルシフェラーゼアッセイの結果を示す。
図１６ａは、図６ａに示す前処理した肝臓常在ANKL1細胞の教師なしクラスタリングを示す。図１６ｂは、肝常在ANKL1細胞の細胞周期スコアリング解析の結果を示す。図１６ｃは、クラスターごとの肝常在ANKL1細胞のSLC7A5発現のバイオリンプロットを示す。図１６ｄは、JPH-203又はジメチルスルホキシド（DMSO）で処理したANKL1-PDXのフローサイトメトリー解析を示す。1群につき計2匹のマウスを分析し、すべてのマウスは衰弱し、13日目に安楽死の上解析を行った。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下に本発明を詳細に説明する。以下に説明する本発明の各特徴は任意に組み合わせることができる。
（【００１１】以降は省略されています）

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