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公開番号2025160188
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-10-22
出願番号2025109136,2022517222
出願日2025-06-27,2020-09-16
発明の名称標的ゲノム修飾のための高度に効率的なRNA-アプタマー動員媒介性DNA塩基エディターおよびそれらの使用
出願人ラトガース,ザステートユニバーシティオブニュージャージー
代理人IBC一番町弁理士法人
主分類C12N 15/09 20060101AFI20251015BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】標的遺伝子編集のためのシステムを提供する。
【解決手段】CRISPRタンパク質とウラシルDNAグリコシラーゼ阻害剤ペプチドを有する配列標的指向性成分またはそれをコードするポリヌクレオチド、ガイドRNA配列を含む核酸標的指向性モチーフと該CRISPRタンパク質に結合するRNAモチーフと動員RNAモチーフを含むRNAスキャホールドまたはそれをコードするDNAポリヌクレオチド、ならびに、該動員RNAモチーフに結合するRNA結合ドメインとリンカーとエフェクタードメインを含むエフェクター融合タンパク質またはそれをコードするポリヌクレオチドを含み、該エフェクター融合タンパク質または該エフェクタードメインはシチジン脱アミノ化活性またはアデノシン脱アミノ化活性を有し、該CRISPRタンパク質がヌクレアーゼ活性を有しない、または二本鎖切断を生成するためのヌクレアーゼ活性を有しない、システム。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
（ｉ）配列標的指向性成分またはそれをコードするポリヌクレオチドであって、前記成分は、
（ａ）配列標的指向性タンパク質、および
（ｂ）第１のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）阻害剤ペプチド（ＵＧＩ）
を有する標的融合タンパク質を含む、配列標的指向性成分またはそれをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）ＲＮＡスキャホールドまたはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチドであって、前記スキャホールドは、
（ａ）標的核酸配列に相補的なガイドＲＮＡ配列を含む核酸標的指向性モチーフ、
（ｂ）前記配列標的指向性タンパク質に結合することが可能なＲＮＡモチーフ、および
（ｃ）第１の動員ＲＮＡモチーフ
を含む、ＲＮＡスキャホールドまたはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチド；ならびに
（ｉｉｉ）第１のエフェクター融合タンパク質またはそれをコードするポリヌクレオチドであって、前記タンパク質は、
（ａ）前記第１の動員ＲＮＡモチーフに結合することが可能な第１のＲＮＡ結合ドメイン、
（ｂ）リンカー、および
（ｃ）エフェクタードメイン
を含む、第１のエフェクター融合タンパク質またはそれをコードするポリヌクレオチド
を含み、前記第１のエフェクター融合タンパク質または前記エフェクタードメインは、シトシン脱アミノ化活性またはアデノシン脱アミノ化活性を有する、システム。
続きを表示（約 1,200 文字）【請求項２】
前記標的融合タンパク質は、２つ以上のＵＧＩをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記ＲＮＡスキャホールドは、２つ以上の動員ＲＮＡモチーフをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記配列標的指向性タンパク質、前記第１のＵＧＩ、前記第２のＵＧＩ、前記ＲＮＡ結合ドメイン、および前記エフェクタードメインをコードするポリヌクレオチドの１つまたは複数は、真核細胞発現または哺乳動物の細胞での発現のために最適化されている、請求項１～３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５】
前記配列標的指向性成分または前記第１のエフェクター融合タンパク質は、１つまたは複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６】
前記配列標的指向性成分は、２つのＮＬＳを含む、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
前記配列標的指向性タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質である、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記配列標的指向性タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を有していない、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記配列標的指向性タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・アガラクチア、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ナイセリア・メニンギティディス、およびトレポネーマ・デンティコラからなる群から選択される種のｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９の配列を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１０】
前記第１の動員ＲＮＡモチーフおよび前記第１のＲＮＡ結合ドメインは、
テロメラーゼＫｕ結合モチーフおよびＫｕタンパク質またはそのＲＮＡ結合区画、
テロメラーゼＳｍ７結合モチーフおよびＳｍ７タンパク質またはそのＲＮＡ結合区画、
ＭＳ２ファージオペレーターステムループおよびＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）またはそのＲＮＡ結合区画、
ＰＰ７ファージオペレーターステムループおよびＰＰ７コートタンパク質（ＰＣＰ）またはそのＲＮＡ結合区画、
ＳｆＭｕファージＣｏｍステムループおよびＣｏｍＲＮＡ結合タンパク質またはそのＲＮＡ結合区画、ならびに
上記アプタマーの化学的修飾版およびそれらの対応するアプタマーリガンドまたはそれらのＲＮＡ結合区画、ならびに非天然ＲＮＡアプタマーおよび対応するアプタマーリガンドまたはそのＲＮＡ結合区画
からなる群から選択される対である、請求項１～９のいずれか１項に記載のシステム。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年９月１７日に出願された米国特許仮出願第６２／９０１，５８４号の優先権を主張するものであり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 4,000 文字）【０００２】
技術分野
本発明は、標的ゲノム修飾のためのシステムおよびその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはクラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓ）システムなどの遺伝子編集技術は、バイオテクノロジーおよび生物医学研究一般のための強力なツールを提供する。また、そうした遺伝子編集技術は、遺伝子疾患、がん、およびウイルス感染などの標的療法の体系的開発に対する期待を生み出した。しかしながら、遺伝子編集技術には、臨床現場で広く使用される前に対処する必要のある重大な制限がある。第１に、従来の遺伝子編集システムは、標的部位にＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成することに依存しており、これは、特に意図されていないオフターゲット活性が高い場合は、潜在的に有害な帰結を示す可能性がある（１、２）。対のニッカーゼ（ｐａｉｒｅｄｎｉｃｋａｓｅｓ）（３）、二量体ヌクレアーゼに融合された触媒的に不活性なＣａｓ９（４、５）、または高フィデリティーＣＲＩＳＰＲシステム（６、７）などの戦略の開発は、そうした有害効果を軽減すると考えられているが、オンターゲットおよびオフターゲット突然変異誘発を正確に評価するための検出方法に制限があるため、遺伝子編集介入の実際の有害効果は過小評価されている可能性がある。近年、ＣＲＩＳＰＲシステムにより生成されたＤＳＢは、オンターゲット部位において、数キロベースに及ぶこれまで気付かれていなかった欠失および再編成を誘導することが示されている（８）。同様に、標的特異性を増強すると考えられている方法である、精製Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を使用した実験で、挿入変異誘発が観察されている（９）。第２に、点突然変異などの精密な修飾を導入するためには、多くの場合、標的細胞が相同性依存性ＤＮＡ二本鎖切断修復（ＨＤＲ）を起こすことが必要である（１０、１１）。しかしながら、体細胞、特に最終分化体細胞では、ＨＤＲ活性が高くなく、代わりにエラーが発生しやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路が使用される（１２）。こうした知見は、安全で有効な療法を開発するための新しい遺伝子編集システムの必要性を浮き彫りにしている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、少なからぬ態様では、上記で言及されている必要性に取り組むものである。
【０００５】
一態様では、本発明は、（ｉ）配列標的指向性成分またはそれをコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）ＲＮＡスキャホールドまたはそれをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡなど）；および（ｉｉｉ）第１のエフェクター融合タンパク質またはそれをコードするポリヌクレオチドを含むシステムを提供する。配列標的指向性成分は、（ａ）配列標的指向性タンパク質および（ｂ）第１のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）阻害剤ペプチド（ＵＧＩ）を有する標的融合タンパク質を含む。ＲＮＡスキャホールドは、（ａ）標的核酸配列に相補的なガイドＲＮＡ配列を含む核酸標的指向性モチーフ、（ｂ）配列標的指向性タンパク質に結合することが可能なＲＮＡモチーフ（例えば、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲモチーフ）、および（ｃ）第１の動員ＲＮＡモチーフ（ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ
ＲＮＡｍｏｔｉｆ）を含む。第１のエフェクター融合タンパク質は、（ａ）第１の動員ＲＮＡモチーフに結合することが可能な第１のＲＮＡ結合ドメイン、（ｂ）リンカー、および（ｃ）エフェクタードメインを含む。第１のエフェクター融合タンパク質またはエフェクタードメインは、シトシン脱アミノ化活性またはアデノシン脱アミノ化活性などの酵素活性を有する。一実施形態では、例示的なシステムは、Ｃａｓ－ＲＮＡアプタマー媒介性のＣからＵへの復帰変異（ＣａｓＲＣｕｒｅまたはＣＲＣ、Ｃａｓ－ＲＮＡａｐｔａｍｅｒｍｅｄｉａｔｅｄＣｔｏＵＲｅｖｅｒｓｉｏｎ）システムと呼ばれる。追加の例示的なシステムとしては、本明細書に記載のような第２世代ＣＲＣシステムＣＲＣ＿ＡＩＤ（
Ａ
ＣＲＣｎｕ、
Ａ
ＣＲＣｎｕ．２）およびＣＲＣ＿ＡＰＯＢＥＣ１（
Ａ１
ＣＲＣｎｕ．、
Ａ１
ＣＲＣｎｕ．２）が挙げられる（ｕは、システムにＵＧＩが存在することを示す）。
【０００６】
本発明のシステムでは、標的融合タンパク質は、１つ、２つ、またはそれよりも多くのＵＧＩを含んでいてもよい。ＲＮＡスキャホールドは、１つ、２つ、またはそれよりも多くの動員ＲＮＡモチーフを含んでいてもよい。したがって、標的融合タンパク質は、２つ以上のＵＧＩ（例えば、第２のＵＧＩ）をさらに含んでいてもよい。ＲＮＡスキャホールドは、２つ以上の動員ＲＮＡモチーフ（例えば、第２の動員ＲＮＡモチーフ）をさらに含んでいてもよい。好ましくは、１つの、それよりも多くの、またはすべてのコード配列は、コドン最適化されている。例えば、配列標的指向性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの１つまたは複数は、第１のＵＧＩ、第２のＵＧＩ、ＲＮＡ結合ドメイン、およびエフェクタードメインは、真核細胞（例えば、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞）での発現のために最適化されている。配列標的指向性成分および第のエフェクター融合タンパク質の各々は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を有していてもよい。例えば、配列標的指向性成分または第１のエフェクター融合タンパク質は、１つまたは複数のＮＬＳを含む。一実施形態では、配列標的指向性成分は、２つのＮＬＳを含む。その場合、２つのＮＬＳは、図９Ｃに示されているように、それぞれ、配列標的指向性成分のＮ末端およびＣ末端に存在してもよい。
【０００７】
上記のシステムでは、配列標的指向性タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質であってもよい。配列標的指向性タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を有していない。配列標的指向性タンパク質の例としては、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、およびトレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａ）からなる群から選択される種のｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９の配列が挙げられる。
【０００８】
上記で言及されているＲＮＡスキャホールドでは、第１の動員ＲＮＡモチーフおよび第１のＲＮＡ結合ドメインは、以下のものからなる群から選択される対であってもよい：（１）テロメラーゼＫｕ結合モチーフおよびＫｕタンパク質またはそのＲＮＡ結合区画、（２）テロメラーゼＳｍ７結合モチーフおよびＳｍ７タンパク質またはそのＲＮＡ結合区画、（３）ＭＳ２ファージオペレーターステムループおよびＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）またはそのＲＮＡ結合区画、（４）ＰＰ７ファージオペレーターステムループおよびＰＰ７コートタンパク質（ＰＣＰ）またはそのＲＮＡ結合区画、（５）ＳｆＭｕファージＣｏｍステムループおよびＣｏｍＲＮＡ結合タンパク質またはそのＲＮＡ結合区画、（６）上記で言及されているアプタマーの化学的修飾版およびそれらの対応するアプタマーリガンドまたはそのＲＮＡ結合区画、ならびに（７）非天然ＲＮＡアプタマーおよび対応するアプタマーリガンドまたはそのＲＮＡ結合区画。
【０００９】
エフェクター融合タンパク質は、種々の好適な酵素活性を有してもよい。一実施形態では、エフェクターは、ヒト、ラット、マウス、コウモリ、ハダカデバネズミ、ゾウ、ニワトリ、トカゲ、ゾウガメ、シーラカンス、および他の脊椎動物種からなる群から選択される種の、野生型または遺伝子改変版のＡＩＤ、ＣＤＡ、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、または他のＡＰＯＢＥＣファミリー酵素などの、シチジン脱アミノ化活性を有してもよい。別の実施形態では、エフェクターは、細菌、酵母、ヒト、ラット、マウス、コウモリ、ハダカデバネズミ、ゾウ、ニワトリ、トカゲ、ゾウガメ、シーラカンス、および他の脊椎動物種からなる群から選択される種の、野生型または遺伝子改変版のＡＤＡ、ＡＤＡＲファミリー酵素、またはｔＲＮＡアデノシンデアミナーゼなどの、アデニン脱アミノ化活性を有してもよい。リンカー配列は、０～１００（例えば、１～１００、５～８０、１０～５０、および２０～３０）アミノ酸残基長であってもよい。
【００１０】
また、上記に記載のシステムの成分（ｉ）～（ｉｉｉ）の１つまたは複数をコードする単離された核酸、核酸を含む発現ベクター、または核酸を含む宿主細胞が提供される。
（【００１１】以降は省略されています）

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