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公開番号2025157248
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-10-15
出願番号2025105965,2023072993
出願日2025-06-23,2020-01-22
発明の名称真核宿主細胞において多量体タンパク質を産生する方法
出願人ジェネンテック, インコーポレイテッド
代理人園田・小林弁理士法人
主分類C12P 21/00 20060101AFI20251007BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】真核生物又は哺乳動物の宿主細胞系において、正しく組み立てられた多量体ポリペプチド(例えば、2つ以上のサブユニットを含み、各サブユニットが2つ以上のポリペプチド鎖を含むもの、例えば、多重特異性又は二重特異性抗体)の産生を改善することを可能にする方法を提供する。
【解決手段】いくつかの実施態様では、多量体ポリペプチドの各ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに作用可能に結合した翻訳開始配列を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞を使用して、真核宿主細胞において多量体ポリペプチドを産生するための方法が提供される。有利には、本開示は、各オープンリーディングフレームに結合した翻訳開始配列の強度を調整することにより、誤対合した副産物を少なくし、多量体ポリペプチドの産生量を高くすることができることを実証する。本開示は、これらに関する細胞、スクリーニング方法、及びキットをさらに提供する。
【選択図】図20A
特許請求の範囲【請求項１】
真核宿主細胞において多量体ポリペプチドを産生するための方法であって、多量体ポリペプチドが、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含む第１のサブユニットと、第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖を含む第２のサブユニットとを含み、
以下：
（ａ）真核宿主細胞を用意することであって、
真核宿主細胞が、第１のポリペプチド鎖をコードする第１のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第１の翻訳開始配列を含む第１のポリヌクレオチドと、第２のポリペプチド鎖をコードする第２のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第２の翻訳開始配列を含む第２のポリヌクレオチドと、第３のポリペプチド鎖をコードする第３のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第３の翻訳開始配列を含む第３のポリヌクレオチドと、第４のポリペプチド鎖をコードする第４のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第４の翻訳開始配列を含む第４のポリヌクレオチドとを含み、
各サブユニットが真核宿主細胞において個別に発現されるとき、第１のサブユニットが第２のサブユニットよりも低いレベルで発現され、
第１の翻訳開始配列及び第２の翻訳開始配列の一方又は両方が、第３の翻訳開始配列及び第４の翻訳開始配列の一方又は両方よりも弱い、
真核宿主細胞を用意することと、
（ｂ）第１、第２、第３、及び第４のポリペプチド鎖の発現に適した条件下で真核宿主細胞を培養することであって、発現時に、第１、第２、第３、及び第４のポリペプチド鎖が多量体ポリペプチドを形成する、真核宿主細胞を培養することと、
（ｃ）真核宿主細胞によって産生された多量体ポリペプチドを回収することと、
を含む、方法。
続きを表示（約 890 文字）【請求項２】
すべてのサブユニットが同じ宿主細胞において発現されるとき、第１のサブユニットの一方又は両方のポリペプチド鎖が、第２のサブユニットの一方又は両方のポリペプチド鎖よりも低いレベルで発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１、第２、第３、及び第４の翻訳開始配列のすべてが、配列（５’から３’）ＮＮＮＮＮＡＴＧＮＧＡを含み、ここで、Ｎは、Ｃ、Ｇ、Ａ、又はＴ／Ｕ（配列番号１）である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
第１の翻訳開始配列及び第２の翻訳開始配列の一方又は両方が、配列番号８－１０からなる群より選択される配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
第３の翻訳開始配列及び第４の翻訳開始配列の一方又は両方が、配列ＡＣＣＡＴＧＧ（配列番号３）又はＧＡＡＧＴＡＴＧＡ（配列番号１１）を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
第１の翻訳開始配列が配列番号９の配列を含み、第２の翻訳開始配列が配列番号９の配列を含み、第３の翻訳開始配列が配列番号２の配列を含み、第４の翻訳開始配列が配列番号１１の配列を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
第１、第２、第３、及び第４のポリヌクレオチドのそれぞれが、プロモーターに作用可能に結合している、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとが同じプロモーターに作用可能に結合しており、第３のポリヌクレオチドと第４のポリヌクレオチドとが同じプロモーターに作用可能に結合している、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第１の翻訳開始配列が第３の翻訳開始配列よりも弱い、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
第２の翻訳開始配列が第４の翻訳開始配列よりも弱い、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
［０００１］本出願は、２０１９年１月２３日出願の米国仮出願第６２／７９６，０１４号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 3,300 文字）【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
［０００２］以下のＡＳＣＩＩテキストファイルによる提出の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形態（ＣＲＦ）（ファイル名：１４６３９２０４５２４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：：２０２０年１月２２日、サイズ：５ＫＢ）。
【０００３】
［０００３］本開示は、真核生物（例えば、哺乳動物）宿主細胞において多量体ポリペプチドを産生するための方法、並びにそれに関連する細胞、方法、及びキット又は製造品に関する。
【背景技術】
【０００４】
［０００４］治療用抗体は、最も成功した生物学的薬物の代表である。過去３０年の間に、４０以上の治療用抗体が、がん、自己免疫、感染症、及び血管疾患を含む様々な適応症において臨床使用が承認されている。このように、治療用抗体は製薬業界で最も成長している分野の一つであり、その臨床的影響は顕著である。
【０００５】
［０００５］ほとんどの疾患は、複数の並行したシグナル伝達経路を有するため、受容体及びリガンドを複数回阻害することで、より優れた治療効果が得られる場合がある。したがって、２つの異なるエピトープに結合する能力を有する二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）は、とりわけ、炎症性疾患及び自己免疫疾患（ＣｈａｎＡＣ，ＣａｒｔｅｒＰＪ．ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ．２０１０；１０（５）：３０１－１６）、がん（ＫｏｕＧ，ＳｈｉＪ，ＣｈｅｎＬ，ＺｈａｎｇＤ，ＨｏｕＳ，ＺｈａｏＬ，ｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔ．２０１０；２９９（２）：１３０－６；ＤｏｎｇＪ，ＳｅｒｅｎｏＡ，ＡｉｖａｚｉａｎＤ，ＬａｎｇｌｅｙＥ，ＭｉｌｌｅｒＢＲ，ＳｎｙｄｅｒＷＢ，ｅｔａｌ．ＭＡｂｓ．２０１１；３（３）：２７３－８８）、及び感染症疾患（ＤｅＢｅｒｎａｒｄｉｓＦ，ＬｉｕＨ，Ｏ’ＭａｈｏｎｙＲ，ＬａＶａｌｌｅＲ，ＢａｒｔｏｌｌｉｎｏＳ，ＳａｎｄｉｎｉＳ，ｅｔａｌ．ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ．２００７；１９５（１）：１４９－５７；ＬａｖｅｎｔｉｅＢＪ，ＲａｄｅｍａｋｅｒＨＪ，ＳａｌｅｈＭ，ｄｅＢｏｅｒＥ，ＪａｎｓｓｅｎｓＲ，ＢｏｕｒｃｉｅｒＴ，ｅｔａｌ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２０１１；１０８（３９）：１６４０４－９）などの多面的な疾患治療への応用が期待できるものとして浮上してきた（ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎＲＥ．ＭＡｂｓ．２０１２；４（２）：１８２－９７；ＢｒｉｎｋｍａｎｎＵ，ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎＲＥ．ＭＡｂｓ．２０１７；９（２）：１８２－２１２；ＣａｒｔｅｒＰＪ，ＬａｚａｒＧＡ．ＮａｔＲｅｖＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ．２０１８；１７（３）：１９７－２２３）。過去数十年の間に、遺伝子工学によって６０種類以上の異なる二重特異性抗体のフォーマットがもたらされ、ｂｓＡｂの免疫原性、薬物動態特性、及び分布が改善された（ＳｐｉｅｓｓＣ，ＺｈａｉＱ，ＣａｒｔｅｒＰＪ．ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ．２０１５；６７（２ＰｔＡ）：９５－１０６）。
【０００６】
［０００６］ｂｓＡｂの用途にかかわらず、２つの異なる重鎖と２つの異なる軽鎖が乱雑に対になり、１６の異なる組み合わせになるが、二重特異性であるのは１つだけであるため、前臨床及び臨床開発をサポートするために十分な量、品質、及びアセンブリを産生することが困難であることから、製造プロセスは困難であった。抗体工学は、重鎖又は軽鎖をそれぞれノブ－イントゥ－ホール及びｃｒｏｓｓＭａｂ技術でヘテロ二量化することにより、鎖の誤対合の問題を軽減するために使用されてきた（ＲｉｄｇｗａｙＪＢ，ＰｒｅｓｔａＬＧ，ＣａｒｔｅｒＰ．ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．１９９６；９（７）：６１７－２１；ＡｔｗｅｌｌＳ，ＲｉｄｇｗａｙＪＢ，ＷｅｌｌｓＪＡ，ＣａｒｔｅｒＰ．ＪＭｏｌＢｉｏｌ．１９９７；２７０（１）：２６－３５；ＭｅｒｃｈａｎｔＡＭ，ＺｈｕＺ，ＹｕａｎＪＱ，ＧｏｄｄａｒｄＡ，ＡｄａｍｓＣＷ，ＰｒｅｓｔａＬＧ，ｅｔａｌ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８；１６（７）：６７７－８１）。製造プロセスの解決策としては、半抗体の別個の発現と、その後のｂｓＡｂへのｉｎｖｉｔｒｏ組立を採用している（ＳｐｉｅｓｓＣ，ＭｅｒｃｈａｎｔＭ，ＨｕａｎｇＡ，ＺｈｅｎｇＺ，ＹａｎｇＮＹ，ＰｅｎｇＪ，ｅｔａｌ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３；３１（８）：７５３－８）。しかし、これは２つの異なる安定した細胞株を生成するため、製造プロセスに時間とコストがかかることと関連している。
【０００７】
［０００７］したがって、２つの抗体を単一の細胞内で共発現させることは、より簡単である可能性があるが、同時に、軽鎖をその同種重鎖に誘導し、望ましくない副産物の存在及び複雑な精製プロセスの必要性を回避して、適切な量の正しく組み立てられたｂｓＡｂを達成するために、発現系のより広範な最適化が頻繁に必要となる。
【０００８】
［０００８］過去数十年にわたり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞は、バイオ医薬品産業の主要な宿主として浮上してきた（ＷｕｒｍＦＭ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４；２２（１１）：１３９３－８）。バイオプロセスの革新及び細胞工学の努力により、産生物力価が改善された（ＡｙｙａｒＢＶ，ＡｒｏｒａＳ，ＲａｖｉＳＳ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７；１１６：５１－６２；ＫｅｌｌｅｙＢ，ＫｉｓｓＲ，ＬａｉｒｄＭ．ＡｄｖＢｉｏｃｈｅｍＥｎｇＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１８．Ｅｐｕｂ２０１８／０５／０４）。しかし、未解明の細胞プロセス及び遺伝子制御メカニズムは、依然として、細胞成長、特異的生産性、及びタンパク質の品質を妨げる要因となっている。現在、哺乳動物細胞内で組み換えタンパク質の翻訳レベルを正確に制御する体系的なアプローチはほとんど存在しない。
【０００９】
［０００９］二重特異性抗体のような複雑な抗体フォーマットの工学は進歩してきたが、単一の哺乳動物発現系における製造可能性は低いパフォーマンスを示すことが多い。低い力価と不十分な産生物品質は、ｂｓＡｂの安定した産生を困難にする要因の２つである。結果として、産生系における制限的な工程を同定し、例えば真核生物又は哺乳動物の宿主細胞系において、正しく組み立てられた多量体ポリペプチドの産生を改善することを可能にする方法を提供することが急務となっている。
【００１０】
［００１０］特許出願、特許公報、非特許文献、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号を含む、本明細書において引用されるすべての参考文献は、個々の参考文献がそれぞれ参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
（【００１１】以降は省略されています）

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