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公開番号2025138517
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-09-25
出願番号2024037655
出願日2024-03-11
発明の名称標的物質の存在状態の判定方法、キット、及び標的物質の存在状態の判定装置
出願人三井化学株式会社
代理人弁理士法人太陽国際特許事務所
主分類C12Q 1/6844 20180101AFI20250917BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】簡便であり検出限界値が低い、標的物質の存在状態の判定方法、並びに前記判定方法に用いるキット及び判定装置を提供する。
【解決手段】試料中の標的物質の存在状態の判定方法であって、明細書にて定義の(A)～(E)を含む、判定方法。
【選択図】図5
特許請求の範囲【請求項１】
試料中の標的物質の存在状態の判定方法であって、
（Ａ）試料を準備することと、
（Ｂ）前記試料に、前記標的物質に結合可能な第一の標的結合分子と、前記第一の標的結合分子に結合しているか又は結合可能なシグナル核酸と、を含む第１複合体を添加することにより、前記標的物質と前記第１複合体とが前記第一の標的結合分子を介して結合してなる第２複合体を得ることと、
（Ｃ）前記第２複合体に、
前記シグナル核酸中の７塩基以上の連続領域に対して配列相補性を有する第１鋳型認識領域を含む第１鋳型核酸と、
前記シグナル核酸中の７塩基以上の連続領域に対して配列同一性を有する第２鋳型対応領域を含む第２鋳型核酸と、
ポリメラーゼと、
ニック形成酵素と、
ラムダエキソヌクレアーゼと、を添加することと、
（Ｄ）前記（Ａ）～（Ｃ）の後に、５０℃以下の温度範囲で核酸増幅反応を行うことと、（Ｅ）前記（Ｄ）の後に、増幅産物を検出することと、
を含み、
前記シグナル核酸は、上流から順に、第２鋳型核酸に対して配列同一性を有する領域と、第１鋳型核酸に対して配列相補性を有する領域と、を含み、
下記（Ｘ）又は（Ｙ）を満たす、判定方法。
（Ｘ）前記第２鋳型核酸が、上流から順に、安定化領域と、ニック形成部位と、前記第２鋳型対応領域と、を含み、前記ニック形成酵素は、前記第１鋳型核酸、前記第２鋳型核酸、及び前記シグナル核酸のうち、前記第２鋳型核酸のみにおいてニックを形成し得る。
（Ｙ）前記第１鋳型核酸が、上流から順に、安定化領域と、ニック形成部位と、前記第１鋳型認識領域と、を含み、前記ニック形成酵素は、前記第１鋳型核酸、前記第２鋳型核酸、及び前記シグナル核酸のうち、前記第１鋳型核酸のみにおいてニックを形成し得る。
続きを表示（約 840 文字）【請求項２】
前記標的物質が、タンパク質、核酸、糖、低分子化合物、微生物、ウイルス、及び細胞からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の判定方法。
【請求項３】
前記第一の標的結合分子が、抗体、アプタマー、ビオチン、ストレプトアビジン、チオール、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、アルキン、及びアジド化合物からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の判定方法。
【請求項４】
第１複合体において、前記第一の標的結合分子と、前記シグナル核酸とは、ビオチンとストレプトアビジンとを介して、間接的に結合している又は間接的に結合可能である、請求項１に記載の判定方法。
【請求項５】
複数種類の第一の標的結合分子と、複数種類のシグナル核酸及び前記複数種類のシグナル核酸に対応する複数種類の第１鋳型核酸と、を用いることによって、複数種類の標的物質の存在状態を判定する、請求項１に記載の判定方法。
【請求項６】
前記（Ａ）において、前記標的物質は基材に固定化されるか、又は固定化されない、請求項１に記載の判定方法。
【請求項７】
前記（Ａ）において、前記試料は基材上に準備され、前記（Ａ）及び（Ｂ）の後に前記（Ｃ）が行われ、前記（Ａ）及び（Ｂ）の後かつ前記（Ｃ）の前に、前記基材を洗浄することをさらに含む、請求項１に記載の判定方法。
【請求項８】
前記（Ａ）において、前記試料は基材上に準備され、前記基材の材料は、ポリスチレン、ポリプロピレン、金コロイド、及び磁性粒子からなる群より選択される、請求項１に記載の判定方法。
【請求項９】
前記ポリメラーゼが鎖置換活性を有する、請求項１に記載の判定方法。
【請求項１０】
前記核酸増幅反応は、等温増幅反応である、請求項１に記載の判定方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
試料中の標的物質の検出方法として各種技術が知られている。例えば、核酸の高感度な検出方法としては、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）等の核酸増幅を用いる方法が一般的に知られている。また、温度サイクルを必要とするＰＣＲに代わり、ＳＤＡ法（Strand Displacement Amplification；鎖置換型増幅法）、ＮＥＡＲ法（Nicking Enzyme Amplification Reaction）、ＬＡＭＰ法（Loop-Mediated Isothermal Amplification）、ＩＣＡＮ法（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）等の等温増幅反応を用いる方法も知られている。検出対象が核酸に限られず汎用性の高い方法としては、標的物質に抗体又は抗原を結合させ、酵素反応を利用して標的物質の存在を検出するＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）が挙げられる。
続きを表示（約 6,500 文字）【０００２】
ＥＬＩＳＡの感度向上等を目的とした各種応用技術も開発が進められている。例えば、非特許文献１では、ＤＮＡを連結させた抗体で標的物質を捕捉し、リアルタイムＰＣＲにより当該ＤＮＡを増幅させることで高感度に標的物質を検出するＩｍｍｕｎｏ－ＰＣＲと呼ばれる方法が記載されている。また、非特許文献２では、イムノアッセイにＥＸＰＡＲ（Exponential Amplification Reaction）法と呼ばれる手法を組み合わせたＩＭＥＸＰＡＲ法によりＭＵＣ１（tumor protein Mucin 1）を高感度に検出したことが記載されている。また、通常のＥＬＩＳＡ法では洗浄により余剰の抗体を除去する操作が必要だが、非特許文献３では、あるＤＮＡを連結させた抗体と、それと配列相補性を有するＤＮＡを連結させた抗体とを用い、それらが同一の標的物質に結合してハイブリダイズすると増幅が起こるように設計することで、抗体の洗浄操作を経ることなく抗体を検出する方法（近接アッセイ又は近接伸長アッセイと呼ばれる）も報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
Science, Volume 258, No.5079,2 October, 1992, Pages 120-122
Talanta, Volume 204, 1 November 2019, Pages 248-254
Nucleic Acids Res., Volume 39, No.15, 6 June 2011, e102
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一方、一般的に用いられる標的物質の検出方法は、感度が十分でなかったり、ＰＣＲのような精密な温度制御や高温反応が要求されたりする場合が多く、汎用性の面で十分ではないことが多かった。かかる状況に鑑み、本開示は、簡便であり検出限界値が低い、標的物質の存在状態の判定方法、並びに前記判定方法に用いるキット及び判定装置の提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するための手段は、以下の態様を含む。
＜１＞試料中の標的物質の存在状態の判定方法であって、
（Ａ）試料を準備することと、
（Ｂ）前記試料に、前記標的物質に結合可能な第一の標的結合分子と、前記第一の標的結合分子に結合しているか又は結合可能なシグナル核酸と、を含む第１複合体を添加することにより、前記標的物質と前記第１複合体とが前記第一の標的結合分子を介して結合してなる第２複合体を得ることと、
（Ｃ）前記第２複合体に、
前記シグナル核酸中の７塩基以上の連続領域に対して配列相補性を有する第１鋳型認識領域を含む第１鋳型核酸と、
前記シグナル核酸中の７塩基以上の連続領域に対して配列同一性を有する第２鋳型対応領域を含む第２鋳型核酸と、
ポリメラーゼと、
ニック形成酵素と、
ラムダエキソヌクレアーゼと、を添加することと、
（Ｄ）前記（Ａ）～（Ｃ）の後に、５０℃以下の温度範囲で核酸増幅反応を行うことと、（Ｅ）前記（Ｄ）の後に、増幅産物を検出することと、
を含み、
前記シグナル核酸は、上流から順に、第２鋳型核酸に対して配列同一性を有する領域と、第１鋳型核酸に対して配列相補性を有する領域と、を含み、
下記（Ｘ）又は（Ｙ）を満たす、判定方法。
（Ｘ）前記第２鋳型核酸が、上流から順に、安定化領域と、ニック形成部位と、前記第２鋳型対応領域と、を含み、前記ニック形成酵素は、前記第１鋳型核酸、前記第２鋳型核酸、及び前記シグナル核酸のうち、前記第２鋳型核酸のみにおいてニックを形成し得る。
（Ｙ）前記第１鋳型核酸が、上流から順に、安定化領域と、ニック形成部位と、前記第１鋳型認識領域と、を含み、前記ニック形成酵素は、前記第１鋳型核酸、前記第２鋳型核酸、及び前記シグナル核酸のうち、前記第１鋳型核酸のみにおいてニックを形成し得る。
＜２＞前記標的物質が、タンパク質、核酸、糖、低分子化合物、微生物、ウイルス、及び細胞からなる群より選択される少なくとも１つである、＜１＞に記載の判定方法。
＜３＞前記第一の標的結合分子が、抗体、アプタマー、ビオチン、ストレプトアビジン、チオール、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、アルキン、及びアジド化合物からなる群より選択される少なくとも１つである、＜１＞又は＜２＞に記載の判定方法。
＜４＞第１複合体において、前記第一の標的結合分子と、前記シグナル核酸とは、ビオチンとストレプトアビジンとを介して、間接的に結合している又は間接的に結合可能である、＜１＞～＜３＞のいずれか１つに記載の判定方法。
＜５＞複数種類の第一の標的結合分子と、複数種類のシグナル核酸及び前記複数種類のシグナル核酸に対応する複数種類の第１鋳型核酸と、を用いることによって、複数種類の標的物質の存在状態を判定する、＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載の判定方法。
＜６＞前記（Ａ）において、前記標的物質は基材に固定化されるか、又は固定化されない、＜１＞～＜５＞のいずれか１つに記載の判定方法。
＜７＞前記（Ａ）において、前記試料は基材上に準備され、前記（Ａ）及び（Ｂ）の後に前記（Ｃ）が行われ、前記（Ａ）及び（Ｂ）の後かつ前記（Ｃ）の前に、前記基材を洗浄することをさらに含む、＜１＞～＜６＞のいずれか１つに記載の判定方法。
＜８＞前記（Ａ）において、前記試料は基材上に準備され、前記基材の材料は、ポリスチレン、ポリプロピレン、金コロイド、及び磁性粒子からなる群より選択される、＜１＞～＜７＞のいずれか１つに記載の判定方法。
＜９＞前記ポリメラーゼが鎖置換活性を有する、＜１＞～＜８＞のいずれか１つに記載の判定方法。
＜１０＞前記核酸増幅反応は、等温増幅反応である、＜１＞～＜９＞のいずれか１つに記載の判定方法。
＜１１＞前記等温増幅反応が１０℃～５０℃で行われる、＜１０＞に記載の判定方法。
＜１２＞前記（Ｘ）を満たす場合及び（Ｙ）を満たす場合における、前記安定化領域における３塩基以上の連続領域と、前記３塩基以上の連続領域よりも下流に存在する連続領域とが、配列相補性を有してヘアピン構造を形成することが可能である、＜１＞～＜１１＞のいずれか１つに記載の判定方法。
＜１３＞前記（Ｘ）を満たす場合及び（Ｙ）を満たす場合における、前記安定化領域のＴｍ値が３０℃以上である、＜１＞～＜１２＞のいずれか１つに記載の判定方法。
＜１４＞前記（Ｘ）を満たす場合の第２鋳型核酸及び前記（Ｙ）を満たす場合の第１鋳型核酸において、
（１）５’末端の連続する２塩基、
（２）３’末端の連続する２塩基、
（３）ニック形成酵素のニッキングにより生じ得る５’末端の連続する２塩基、及び
（４）ニック形成酵素のニッキングにより生じ得る３’末端の連続する２塩基が、
互いに、配列同一性及び配列相補性のいずれも有さない、＜１＞～＜１３＞のいずれか１つに記載の判定方法。
＜１５＞前記第１鋳型核酸の３’末端と前記第２鋳型核酸の３’末端とを前記シグナル核酸に対してアラインメントした場合、前記第１鋳型認識領域と前記第２鋳型対応領域とは、１塩基以上の間隔を有して配置されるか、間隔無く接するか、又は１塩基以上重複して配置されるか、である、＜１＞～＜１４＞のいずれか１つに記載の判定方法。
＜１６＞前記（Ｘ）を満たす場合の第２鋳型核酸及び前記（Ｙ）を満たす場合の第１鋳型核酸において、３’末端は修飾されている、＜１＞～＜１５＞のいずれか１つに記載の判定方法。
＜１７＞試料中の標的物質の存在状態を判定するためのキットであって、
容器に格納された、標的物質に結合可能な第一の標的結合分子と、前記第一の標的結合分子に結合しているか又は結合可能なシグナル核酸と、を含む第１複合体と、
容器に格納されたポリメラーゼと、
容器に格納されたニック形成酵素と、
容器に格納されたラムダエキソヌクレアーゼと、
容器に格納された第１鋳型核酸と、
容器に格納された第２鋳型核酸と、
を備え、
前記第１鋳型核酸は、前記シグナル核酸中の７塩基以上の連続領域に対して配列相補性を有する第１鋳型認識領域を含み、
前記第２鋳型核酸は、前記シグナル核酸中の７塩基以上の連続領域に対して配列同一性を有する第２鋳型対応領域を含み、
前記シグナル核酸は、上流から順に、第２鋳型核酸に対して配列同一性を有する領域と、第１鋳型核酸に対して配列相補性を有する領域と、を含み、
下記（Ｘ）又は（Ｙ）を満たす、キット。
（Ｘ）前記第２鋳型核酸が、上流から順に、安定化領域と、ニック形成部位と、前記第２鋳型対応領域と、を含み、前記ニック形成酵素は、前記第１鋳型核酸、前記第２鋳型核酸、及び前記シグナル核酸のうち、前記第２鋳型核酸のみにおいてニックを形成し得る。
（Ｙ）前記第１鋳型核酸が、上流から順に、安定化領域と、ニック形成部位と、前記第１鋳型認識領域と、を含み、前記ニック形成酵素は、前記第１鋳型核酸、前記第２鋳型核酸、及び前記シグナル核酸のうち、前記第１鋳型核酸のみにおいてニックを形成し得る。
【発明の効果】
【０００６】
本開示によれば、簡便であり検出限界値が低い、標的物質の存在状態の判定方法、並びに前記判定方法に用いるキット及び判定装置が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
図１は、（Ｘ）を満たす方法における、シグナル核酸と第１鋳型核酸と第２鋳型核酸との関係を示す模式図である。
図２は、（Ｘ）を満たす方法における核酸増幅の推定メカニズムを示す模式図である。
図３は、（Ｙ）を満たす方法における、シグナル核酸と第１鋳型核酸と第２鋳型核酸との関係を示す模式図である。
図４は、（Ｙ）を満たす方法における核酸増幅の推定メカニズムを示す模式図である。
図５は、本開示の判定方法の一実施形態における核酸増幅の推定メカニズムの模式図を表す。
図６は、本開示の判定方法の一実施形態における核酸増幅の推定メカニズムの模式図を表す。
図７は、本開示の判定方法の一実施形態における核酸増幅の推定メカニズムの模式図を表す。
図８は、一実施形態における判定装置の機能構成を表す模式図を表す。
図９は、一実施形態における判定装置として機能するコンピュータの概略ブロック図である。
図１０は、実施例の試験区１～試験区７における抗原（対数）と増幅開始時間の変化量をプロットしたグラフである。
図１１は、実施例の試験区９～試験区１１における抗原（ｐｇ）と吸光度をプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本開示の実施形態を実施するための形態について詳細に説明する。但し、本開示の実施形態は以下の実施形態に限定されるものではない。以下の実施形態において、その構成要素（要素ステップ等も含む）は、特に明示した場合を除き、必須ではない。数値及びその範囲についても同様であり、本開示の実施形態を制限するものではない。
【０００９】
本開示において「工程」との語には、他の工程から独立した工程に加え、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の目的が達成されれば、当該工程も含まれる。
本開示において「～」を用いて示された数値範囲には、「～」の前後に記載される数値がそれぞれ最小値及び最大値として含まれる。
本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、一つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
本開示において、複数の要素が、「又は」又は「若しくは」を用いて列挙されている場合、特に明示されている場合を除き、技術的な矛盾が生じない限りは複数の要素を組み合わせて選択することを排除しない。
本開示において要素が単数形で表記されている場合であっても、特に明示されている場合を除き、技術的な矛盾が生じない限りは複数の存在を排除しない。
本開示において、別個に記載されている複数の例示的態様は、互いに矛盾しない限り、互いに組み合わせて新たな態様を構成してもよい。
本開示において実施形態を図面を参照して説明する場合、当該実施形態の構成は図面に示された構成に限定されない。また、各図における部材の大きさは概念的なものであり、部材間の大きさの相対的な関係はこれに限定されない。
本開示において、「核酸」は、あらゆる核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの類似体、天然物、人工物）と、あらゆる核酸に低分子化合物、基、核酸以外の分子、構造物などが連結している核酸とを含む用語である。
【００１０】
≪試料中の標的物質の存在状態の判定方法≫
本開示の判定方法は、試料中の標的物質の存在状態の判定方法であって、
（Ａ）試料を準備することと、
（Ｂ）前記試料に、前記標的物質に結合可能な第一の標的結合分子と、前記第一の標的結合分子に結合しているか又は結合可能なシグナル核酸と、を含む第１複合体を添加することにより、前記標的物質と前記第１複合体とが前記第一の標的結合分子を介して結合してなる第２複合体を得ることと、
（Ｃ）前記第２複合体に、
前記シグナル核酸中の７塩基以上の連続領域に対して配列相補性を有する第１鋳型認識領域を含む第１鋳型核酸と、
前記シグナル核酸中の７塩基以上の連続領域に対して配列同一性を有する第２鋳型対応領域を含む第２鋳型核酸と、
ポリメラーゼと、
ニック形成酵素と、
ラムダエキソヌクレアーゼと、を添加することと、
（Ｄ）前記（Ａ）～（Ｃ）の後に、５０℃以下の温度範囲で核酸増幅反応を行うことと、（Ｅ）前記（Ｄ）の後に、増幅産物を検出することと、
を含み、
前記シグナル核酸は、上流から順に、第２鋳型核酸に対して配列同一性を有する領域と、第１鋳型核酸に対して配列相補性を有する領域と、を含み、
下記（Ｘ）又は（Ｙ）を満たす。
（Ｘ）前記第２鋳型核酸が、上流から順に、安定化領域と、ニック形成部位と、前記第２鋳型対応領域と、を含み、前記ニック形成酵素は、前記第１鋳型核酸、前記第２鋳型核酸、及び前記シグナル核酸のうち、前記第２鋳型核酸のみにおいてニックを形成し得る。
（Ｙ）前記第１鋳型核酸が、上流から順に、安定化領域と、ニック形成部位と、前記第１鋳型認識領域と、を含み、前記ニック形成酵素は、前記第１鋳型核酸、前記第２鋳型核酸、及び前記シグナル核酸のうち、前記第１鋳型核酸のみにおいてニックを形成し得る。
以下、前記（Ａ）～（Ｅ）をそれぞれ「工程（Ａ）」～「工程（Ｅ）」とも記す。
（【００１１】以降は省略されています）

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