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公開番号2025114632
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-08-05
出願番号2025073309,2022117084
出願日2025-04-25,2017-02-03
発明の名称乾燥増幅組成物
出願人ジェン-プローブ・インコーポレーテッド
代理人個人,個人
主分類C12Q 1/686 20180101AFI20250729BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】乾燥増幅組成物の提供。
【解決手段】本開示は、核酸増幅のための試薬をもたらす乾燥組成物を提供し、これは本質的には無機塩を含まない。無機塩の欠如は、こうした組成物の安定性を増加させ、副産物の形成を減少させる。組成物における酵素の使用に必要な塩は、再構成で供給される。本明細書では、ポリメラーゼ及び逆転写酵素からなる群から選択される酵素、充填剤、有機緩衝液、ならびに洗浄剤を含む乾燥組成物が開示される。乾燥組成物は、1つ以上の無機塩も含み、1つ以上の無機塩は、乾燥組成物の総質量の0.350%以下である質量で乾燥組成物中に存在する。
【選択図】図7
特許請求の範囲【請求項１】
少なくとも１つのポリメラーゼと、
トレハロース充填剤と、
洗浄剤と、
有機緩衝液と、
分子アッセイを行うのに有用な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと、
デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）と、
キレート剤と、
０．１ｍＭ未満のマグネシウムイオンと、
を含む水性溶液を含有する組成物であって、前記少なくとも１つのポリメラーゼが、約０．１Ｕ／μｌ～約０．６Ｕ／μｌの濃度で前記水性溶液中に存在する逆転写酵素を含む、組成物。
続きを表示（約 1,100 文字）【請求項２】
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、増幅オリゴヌクレオチド、必要に応じて少なくとも１つの標識を含む検出プローブオリゴヌクレオチド、標的捕捉プローブオリゴヌクレオチド、アダプターオリゴヌクレオチド、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記水性溶液が、マルチプレックス分子アッセイを行うためのオリゴヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記充填剤が、約０．１６Ｍ～約０．３２Ｍの濃度で存在する、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記水性溶液が、約０．１９６μｇ／μｌのカリウムイオン～約０．０１０μｇ／μｌのカリウムイオンを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ｄＮＴＰが、前記水性溶液中０．１ｍＭ～０．３ｍＭの濃度のｄＡＴＰ、前記水性溶液中０．１ｍＭ～０．３ｍＭの濃度のｄＧＴＰ、前記水性溶液中０．１ｍＭ～０．３ｍＭの濃度のｄＣＴＰ、前記水性溶液中０．２ｍＭ～０．６ｍＭの濃度のｄＴＴＰ、又は前記水性溶液中０．２ｍＭ～０．６ｍＭの濃度のｄＵＴＰを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１つのポリメラーゼが、ホットスタートポリメラーゼであるポリメラーゼを含み、必要に応じて、
前記ホットスタートポリメラーゼが、前記ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を特異的に遮断する抗体により結合された組換えＴａｑＤＮＡポリメラーゼである、又は
前記ホットスタートポリメラーゼが、化学修飾された組換えＴａｑＤＮＡポリメラーゼであり、前記化学修飾が、前記ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害する、
請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記逆転写酵素がＡＭＶ逆転写酵素又はＭＭＬＶ逆転写酵素である、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記水性溶液がＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含み、必要に応じて、
前記ＲＮａｓｅ阻害剤が、約０．１２Ｕ／μｌ～約０．２０Ｕ／μｌの濃度で前記水性溶液中に存在する、
請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記キレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＤＤＳ、ＭＧＤＡ、ＥＧＴＡ、及びＤＴＰＡからなる群から選択され、好ましくは
前記キレート剤が、ＥＤＴＡであり、１．５ｍＭ～２．０ｍＭの濃度で前記水性溶液中に存在する、
請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、本明細書に参照により組み込まれる、２０１６年２月５日に出願された米国仮特許出願第６２／２９１，７７０号の優先権を主張する。
続きを表示（約 4,200 文字）【０００２】
背景
核酸増幅及び／または検出反応を行うための市販キットは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）のような１つ以上のポリメラーゼを含む、酵素、ヌクレオチド、洗浄剤、緩衝液、プライマー、プローブ、ならびにＭｎＣｌ
２
、ＭｇＣｌ
２
、ＮａＣｌ、及びＫＣｌを含む、無機塩のような、試薬を含有することが多い（Ｉｎｎｉｓｅｔａｌ，（１９９０）ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｈ．１，ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｓｏｆＰＣＲｓ）。無機塩は、核酸反応混合物の成分の安定化及び核酸ベースの反応の特定のステップを行うのに有用である。しかしながら、これらの同じ塩は、乾燥凍結組成物の安定性及び乾燥性に悪影響を及ぼすので、凍結乾燥及び／または使用前に保存する配合物の望ましくない成分である。
【０００３】
マグネシウムイオンは、ポリメラーゼ及び他の酵素の活性を増加させることが報告されている。塩化カリウムは、核酸ハイブリダイゼーションを促進することが報告されている。マグネシウムを有するものを含む、多数の無機塩は、熱、カオトロピック剤曝露、及び凍結乾燥を含むストレスの様々な条件下でタンパク質を保護することも報告されている（例えば、Ｌｉｕｅｔａｌ（２００７）ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ．５８１：１０４７、Ｋａｎａｙａｅｔａｌ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３２７２９、Ｉｎｎｉｓｅｔａｌ，（１９９０）ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅ
ｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｈ．１，ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｓｏｆＰＣＲｓ、Ｍｅｎｅｎｄｅｚｅｔａｌ（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６７、Ｊａｎｅｗａｙｅｔａｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３２：１６０１、Ｆｏｘｅｔａｌ（１９７１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４６：５７３９、Ｃｈａｎｇｅｔａｌ（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２７７：４６６３、Ｒｕｔｔｅｒｅｔａｌ（１９５８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３３：３７４、Ｈｕｓｚａｒｅｔａｌ（１９８１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３７：５８０－５８８、Ｗａｎｇ（２０００）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ．２０３：１－６０参照）。
反応混合物中の塩の存在は、酵素の変性を回避するのに必要であると考えられている。しかしながら、凍結乾燥された物質の安定性は、凍結乾燥ケーキ中に存在するいかなる塩によっても影響される。凍結乾燥物質の吸湿性は、ひいては、凍結乾燥物質をパッケージングするのに利用可能な時間に影響を及ぼし、凍結乾燥物質を保存及び輸送することができる継続時間及び条件に影響を及ぼす。凍結乾燥物質の望ましくない再水和は、凍結乾燥成分の活性に悪影響を及ぼす。凍結乾燥物質の望ましくない再水和からの悪影響を最小化するために、こうした物質の長期保存は、通常は冷蔵で行われる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
Ｉｎｎｉｓｅｔａｌ，（１９９０）ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｈ．１，ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｓｏｆＰＣＲｓ
Ｌｉｕｅｔａｌ（２００７）ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ．５８１：１０４７
Ｋａｎａｙａｅｔａｌ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３２７２９
Ｍｅｎｅｎｄｅｚｅｔａｌ（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６７
Ｊａｎｅｗａｙｅｔａｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３２：１６０１
Ｆｏｘｅｔａｌ（１９７１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４６：５７３９
Ｃｈａｎｇｅｔａｌ（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２７７：４６６３
Ｒｕｔｔｅｒｅｔａｌ（１９５８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３３：３７４
Ｈｕｓｚａｒｅｔａｌ（１９８１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３７：５８０－５８８
Ｗａｎｇ（２０００）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ．２０３：１－６０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書では、ポリメラーゼを含有する水性溶液、ならびに／または逆転写酵素、充填剤、洗浄剤、及び有機緩衝液を含む組成物が開示され、水性溶液は、７ｍＭ以下の無機塩濃度を有する。
【０００６】
水性溶液のいくつかの実施形態では、水性溶液は、分子アッセイを行うのに有用な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、マルチプレックス分子アッセイを行うためのオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、増幅オリゴマーを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、検出プローブを含む。いくつかの実施形態では、検出プローブは、オリゴヌクレオチドに共有結合した標識を含む。いくつかの実施形態では、標識は、蛍光または化学発光分子である。いくつかの実施形態では、検出プローブは、ＴａｑＭａｎ検出プローブである。いくつかの実施形態では、検出プローブオリゴヌクレオチドは、ヘアピンを形成するように構成される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、アダプターオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、ヘアピンを形成するように構成されたアダプターを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、標的捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、標的捕捉プローブは、ストリンジェントな条件下で標的核酸に特異的にハイブリダイズする、標的ハイブリダイズ部分を有する。いくつかの実施形態では、分子アッセイは、核酸増幅アッセイを含む。いくつかの実施形態では、分子アッセイは、核酸検出アッセイを含む。いくつかの実施形態では、分子アッセイは、核酸シークエンシングアッセイを含む。いくつかの実施形態では、分子アッセイは、核酸ハイブリダイゼーションアッセイを含む。
【０００７】
水性溶液のいくつかの実施形態では、充填剤は、トレハロース、ラフィノース、またはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、充填剤は、約０．１６Ｍ～約０．３２Ｍの濃度で存在する。
【０００８】
水性溶液のいくつかの実施形態では、無機塩は、約０．０２９ｕｇ／ｕｌ～約０．３７３ｕｇ／ｕｌのマイクロリットル当たりの質量で存在する。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．０２９ｕｇ／ｕｌの塩化ナトリウム～約０．２９２ｕｇ／ｕｌの塩化ナトリウムを含有する。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．０１９ｕｇ／ｕｌの塩化カリウム～約０．３７３ｕｇ／ｕｌの塩化カリウムを含有する。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．００６ｕｇ／ｕｌのナトリウムイオン～約０．１１５ｕｇ／ｕｌのナトリウムイオンを含有する。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．０１０ｕｇ／ｕｌのカリウムイオン～約０．１９６ｕｇ／ｕｌのカリウムイオンを含有する。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．００９ｕｇ／ｕｌの塩化物イオン～約０．３５５ｕｇ／ｕｌの塩化物イオンを含有する。
【０００９】
水性溶液のいくつかの実施形態では、水性溶液は、４ｍＭ以下の無機塩濃度を含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．２３４ｕｇ～約０．２９８ｕｇのマイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．０７１ｕｇ～約０．２８４ｕｇのマイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、３ｍＭ以下の無機塩濃度を含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．１７５ｕｇ～約０．２２４ｕｇのマイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．０５３ｕｇ～約０．２１３ｕｇのマイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、２ｍＭ以下の無機塩濃度を含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．１１７ｕｇ～約０．１４９ｕｇのマイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．０３６ｕｇ～約０．１４２ｕｇのマイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、１ｍＭ以下の無機塩濃度を含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．０５８ｕｇ～約０．０７５ｕｇのマイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．０１８ｕｇ～約０．０７１ｕｇのマイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、５００ｕＭ以下の無機塩濃度を含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．０２９ｕｇ～約０．０３７ｕｇのマイクロリットル当たりの質量の無機塩を含む。いくつかの実施形態では、水性溶液は、約０．００９ｕｇ～約０．０３６ｕｇのマイクロリットル当たりの質量の塩化物イオンを含む。
【００１０】
水性溶液のいくつかの実施形態では、水性溶液の無機塩濃度は、１ｍＭ未満の塩化ナトリウムである。いくつかの実施形態では、水性溶液は、塩化ナトリウムを含有しない。いくつかの実施形態では、水性溶液は、１ｍＭ未満のマグネシウムイオンを含有する。いくつかの実施形態では、水性溶液は、０．１ｍＭ未満のマグネシウムイオンを含有し、適切にはマグネシウムイオンを含有しない。
（【００１１】以降は省略されています）

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